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三元复合因子Net基因的克隆及其真核表达 被引量:1
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作者 李百文 倪培华 +1 位作者 诸琦 徐洪 《检验医学》 CAS 北大核心 2009年第6期423-427,共5页
目的克隆人Net基因,构建Net基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中抽提总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出人全长Net cDNA,构建pEGFP-N1/Net重组体质粒,并将其转染入高表达原癌基因c-fos的人胰... 目的克隆人Net基因,构建Net基因表达载体并诱导融合蛋白表达。方法从正常人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中抽提总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出人全长Net cDNA,构建pEGFP-N1/Net重组体质粒,并将其转染入高表达原癌基因c-fos的人胰腺癌细胞PANC-1中,分析转染细胞的Net表达水平和对细胞增殖力的影响。结果从人胰腺癌细胞PANC-1中克隆出长约1 224 bp的Net基因目的片段,成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Net,诱导表达目的蛋白后,Net抑制原癌基因c-fos的表达,进而抑制人胰腺癌细胞的增殖。结论构建重组质粒pEGFP-N1/Net并表达Net融合蛋白,其抑制了细胞的增殖,为进一步研究Net的各种生物学活性及作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 NET 克隆 融合蛋白
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DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG_2细胞的作用
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作者 倪培华 徐洪 +2 位作者 胡亮 胡翊群 姜叙诚 《诊断学理论与实践》 2009年第2期165-170,共6页
目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入H... 目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Westernblot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致。LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P<0.05);Western blot检测到DRAM蛋白表达明显增高;转染pEGFP-N1的HepG2细胞超微结构基本正常,转染DRAM的一些细胞中可见自噬体。结论:本研究成功构建了表达DRAM的真核质粒,并在HepG2细胞中表达,DRAM在肿瘤细胞存在双向效应,既可诱导HepG2细胞发生自噬性死亡,又可促进HepG2细胞增殖。 展开更多
关键词 损伤调节自噬调质 DRAM 自噬 细胞凋亡 载体
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