脂联素基因-3971A/G多态性与脑梗死关系的研究

目的探讨脑梗死患者(CI)与脂联素基因-3971A/G多态性的关系。方法运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对126名对照者和150例CI患者的脂联素基因启动子3971多态性进行检测。结果对照组和CI组的基因型频率分别为67.20%、26.40%、6.40%;82.00%、16.67%、1.33%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P<0.05)。两组的等位基因频率分别为80.40%、19.60%;90.33%、9.67%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P<0.05)。CI组的脂联素基因-3971位各型的TG、血糖、收缩压均明显高于对照组(P<0.05),而TC、HDL-Cn、onHDL-C、LDL-C、舒张压在两组间无统计学意义(P>0.05)。经过多元逐步Logistic回归分析显示TG的OR值为1.414,95%CI(1.059-1.888);血糖的OR值为1.034,95%CI(1.018-1.051);收缩压的OR值为1.339,95%CI(1.098-1.633);GG型的OR值为2.289,95%CI(1.243-4.215)。结论脂联素基因-3971A/G多态性的GG型可能是CI发病的一个独立危险因子。

DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG_2细胞的作用

目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用。方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Westernblot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致。LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P<0.05);Western blot检测到DRAM蛋白表达明显增高;转染pEGFP-N1的HepG2细胞超微结构基本正常,转染DRAM的一些细胞中可见自噬体。结论:本研究成功构建了表达DRAM的真核质粒,并在HepG2细胞中表达,DRAM在肿瘤细胞存在双向效应,既可诱导HepG2细胞发生自噬性死亡,又可促进HepG2细胞增殖。

SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定

目的构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA3．1融合的高效真核表达载体，为研究MSX-2基因的功能奠定基础。方法根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列，设计并合成引物，采用PCR技术，扩增编码MSX-2基因，TA克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体PcDNA3．1的BamHI和Xhol位点。对该重组体进行酶切鉴定，以及测序验证。重组体转染HEK293细胞，RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况。结果重组真核表达载体PcDNA3．1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断，证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中；碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列。重组体转染HEK293细胞，RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达。结论成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体，为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础。