转染中国仓鼠卵巢细胞人TSH受体的功能评价

目的研究转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞人促甲状腺激素(hTSH)受体(hTSHR)的功能。方法抽提已转染hTSHR的CHO细胞基因组DNA,PCR扩增目的条带,并对产物进行序列测定。采用受体的放射配体结合分析法,以固定量125I的牛促甲状腺激素(125I-bTSH)和浓度递增的未标记bTSH与hTSHR发生竞争结合反应分析受体的基本功能;通过TSH刺激试验测定细胞环磷酸腺苷(cAMP)含量,评价hTSHR的生物学活性。结果PCR扩增片段长度与预期相符,且序列完全正确。竞争结合反应表明,随着bTSH浓度的递增,125I-bTSH与hTSHR的结合量逐渐下降;TSH刺激试验显示,随着bTSH浓度的递增,细胞cAMP含量亦逐渐升高,当bTSH浓度为10 mIU/mL时,cAMP水平达到峰值。结论cDNA序列整合在CHO细胞基因组内并在细胞膜上表达的hTSHR,具有受体的基本功能特性和良好的生物学活性。该实验为自身免疫性甲状腺疾病患者血清甲状腺刺激性抗体(TSAb)和阻断性抗体(TSBAb)的检测奠定了基础。

环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用

目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3.1-hTSHR中hTSHR cDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。

蛋白激酶C抑制剂对发育期甲状腺功能减退大鼠智力的改善作用

目的研究发育期甲状腺功能减退(甲减)的大鼠经蛋白激酶C(PKC)抑制剂bisindolylmaleimideⅪ处理后智力的变化,从信号转导途径进一步探讨甲减时鼠脑发育异常的机制。方法2只SD孕鼠自孕第15天起以丙基硫氧嘧啶溶液灌胃,出生的仔鼠即为甲减仔鼠。部分甲减仔鼠于出生当日起腹腔注射PKC抑制剂bisindolylmaleimideⅪ0.6μg.g-1.d-1。另外1只未灌注丙基硫氧嘧啶溶液的雌鼠所产仔鼠作为正常对照组。仔鼠龄达1个月时,对正常对照组(n=8)、甲减组(n=8)、PKC抑制剂处理组(n=8)仔鼠行水迷宫实验测试其智力水平。结果三组仔鼠学习记忆过程存在明显差异。PKC抑制剂组及甲减组皆较正常对照组逃避潜伏期长,找到终点的比率低,游速较正常对照组明显降低;且甲减组比PKC抑制剂组的逃避潜伏期更长,找到终点的比率更低,游速更慢,总体变化有显著性差异(P<0.01)。结论蛋白激酶C抑制剂bisindolylmaleimideⅪ对发育期甲状腺功能减退大鼠的智力有改善作用,PKC信号转导系统可能参与了甲减性脑发育障碍的发生。

用CHO—hTSHR细胞检测甲状腺刺激性抗体的研究

目的研究本课题组所构建的表达人重组TSH受体的中国仓鼠卵巢细胞（CHO—hT—SHR）在检测甲状腺刺激性抗体（TSAb）方面的临床应用价值。方法采用正常对照组及Graves病（GD）甲亢组血清的粗提IgG溶液来刺激CHO—hTSHR细胞，测定反应介质中的cAMP产量，计算TSAb活性。以正常对照组TSAb活性的孟＋2s作为正常上限值，根据该阳性判断标准来计算GD甲亢组TSAb的阳性检出率。结果GD甲亢组cAMP的产量及TSAb活性高于正常对照组[（353．65±126．34）pmol／LVS（237．21±77．15）pmol／L，（149．08±53．26）％ vs（100±32．52）％]，差异有统计学意义（P〈0．05）。采用该细胞测定的TSAb活性的正常上限值为165％，GD甲亢组TSAb的阳性检出率为50％（14／28）。结论本课题组所构建的CHO—hTSHR细胞株在检测GD甲亢患者血清中TSAb水平方面具有一定的临床应用价值。