补骨脂乙素诱导伊马替尼敏感和耐药的慢性粒细胞白血病细胞凋亡

目的探讨补骨脂乙素对伊马替尼敏感和耐药慢性粒细胞白血病细胞的影响。方法体外培养人慢性粒细胞白血病伊马替尼敏感细胞株K562s和伊马替尼耐药细胞株K562r,以不同浓度(0、5、10、20、40μmol/L)补骨脂乙素(IBC)处理K562s和K562r细胞不同时间(0、24、48、72 h),锥虫蓝拒染法检测IBC对K562s和K562r细胞活性的影响,Annexin V/PI、Rh123/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡及线粒体跨膜电位的变化,Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。结果锥虫蓝拒染法检测结果显示:IBC对K562s和K562r均有增殖抑制作用,且呈时间-剂量依赖性。流式细胞术检测结果表明,经[BC处理的K562s和K562r出现明显时间-剂量依赖性的凋亡及线粒体膜电位的降低。Western blotting检测结果显示:经IBC处理的K562s和K562r细胞发生caspase-3活化和PARP-1的剪切。结论 IBC能够诱导K562s和K5621,细胞凋亡,线粒体跨膜电位下降可能参与了这一过程。

蛋白激酶Cδ与细胞凋亡

蛋白激酶Cδ（PKCδ）是细胞内重要的信号转导分子,参与细胞增殖、分化和凋亡过程。在介导细胞凋亡过程中,PKCδ先通过别构效应、磷酸化和剪切等步骤进行激活。活化的PKCδ可启动下游信号通路系统,使c-Abl、P73、DNA-PK、JNK、核纤层蛋白B、NF-κB等促凋亡相关的调控因子活化,促进细胞凋亡。同时,PKCδ也具有抗凋亡的调控功能。现就PKCδ的结构、活化,以及介导细胞凋亡与抗凋亡过程中调控的相关因子作一综述。

低氧诱导因子和白血病细胞分化(英文)

三氧化二砷(As2O3,ATO)是一种新发现的有效治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的药物。研究发现,该药物在体外诱导细胞分化的能力不如体内明显。以此为基础,最近我们意外地发现模拟低氧化合物和中度低氧环境能够直接在体外诱导急性髓系白血病细胞分化,也选择性地加强三氧化二砷诱导的APL细胞分化。进一步地,间歇性低氧能够显著延长移植的白血病小鼠生存时间,并且抑制白血病细胞浸润并诱导其分化。以这些工作为基础,我们就低氧诱导白血病细胞分化的分子机制进行了深入研究。本文将就相关工作作一综述, 并讨论有侍进一步研究的问题。

腺花素通过peroxiredoxinⅠ对端粒酶表达和细胞死亡的影响

目的探讨腺花素对白血病细胞端粒酶的影响和作用机制。方法用不同浓度腺花素(0、2、4、6μmol/L)处理NB4-LR1细胞不同时间(0、6、12、24 h),Western blotting检测人端粒酶逆转录酶(h TERT)蛋白的表达,Real-time PCR检测h TERT mRNA水平。用RNA干扰方法在NB4-LR1细胞内降低peroxiredoxinⅠ(PrdxⅠ)的水平,Western blotting检测h TERT蛋白的表达水平。在NB4-LR1细胞内过表达h TERT,锥虫蓝拒染法检测不同浓度(2、4μmol/L)的腺花素处理NB4-LR1-h TERT-GFP、NB4-LR1-GFP细胞后,细胞的增殖和活力的改变。结果 Western blotting检测结果显示,腺花素能够呈时间-剂量依赖性抑制h TERT的表达。敲除PrdxⅠ后h TERT的表达下降。在NB4-LR1细胞过表达h TERT可以部分抑制腺花素对细胞的毒性作用但不能抑制其诱导的细胞分化。结论腺花素通过PrdxⅠ抑制端粒酶表达,促进细胞的死亡。

槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的作用及机制研究

目的:探讨槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的生长抑制作用及其机制。方法:台盼蓝染色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:25μmol/L槲皮素对伊马替尼耐药的K562细胞株K562R和K562G具有与伊马替尼敏感细胞株K562相似的生长抑制和诱导凋亡作用,且不改变BCR-ABL的表达水平。25μmol/L槲皮素处理24 h后,K562、K562R和K562G细胞的G_2/M期百分比明显增加。槲皮素能使γ-H2AX水平明显增高,且上调JNK的磷酸化水平。结论:槲皮素单药对伊马替尼耐药细胞株具有生长抑制和诱导凋亡作用,使细胞停滞于G_2/M期,其机制可能与上调JNK磷酸化水平导致DNA双链损伤相关。

腺花素对多发性骨髓瘤细胞的生物学效应及其机制研究

目的·探讨腺花素(Aden)对多发性骨髓瘤(MM)细胞的生物学效应与作用机制。方法·不同浓度Aden处理MM细胞H929、U266不同时间后,采用锥虫蓝排斥测试法检测细胞密度与活率;不同浓度Aden处理H929、U266细胞24 h后,采用CCK8检测细胞增殖变化,Annexin V-APC/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达、NF-κB信号通路相关蛋白以及NF-κB调控的下游蛋白变化;采用CETSA方法检测Aden对IKKβ蛋白热力学稳定性的影响。结果·锥虫蓝排斥测试法结果显示:Aden呈时间和剂量依赖性降低H929、U266细胞的活率及抑制细胞的增殖;在同样浓度的Aden处理下,U266较H929细胞更敏感。CCK8结果显示Aden呈剂量依赖性抑制H929、U266细胞的增殖。流式细胞术表明Aden可引起MM细胞轻微凋亡。Western blotting结果显示:H929细胞经Aden处理后未检测到PARP、caspase3的剪切;U266细胞经Aden处理后总蛋白PARP和caspase3下调,同时也可检测到PARP、caspase3的剪切;2株MM细胞经Aden处理后NF-κB信号通路蛋白p-p65、p-IκBα的表达均减少。CETSA结果显示Aden能使IKKβ蛋白热力学稳定性下降。结论·Aden能明显抑制MM细胞H929、U266增殖,但不能显著诱导其凋亡;Aden对MM细胞增殖抑制效应可能与其结合IKKβ进而抑制NF-κB信号通路的活化有关。

CDDO-Me对三阴性乳腺癌细胞泛素特异性蛋白酶2a活性及细胞增殖的抑制作用

目的·在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞中研究筛选得到的泛素特异性蛋白酶2a(ubiquitin-specific protease 2a,USP2a)抑制剂甲基巴多索隆(bardoxolone methyl,CDDO-Me)对USP2a活性及细胞增殖的影响。方法·利用泛素特异性蛋白酶抑制剂筛选系统筛选得到USP2a抑制剂CDDO-Me,采用分子对接分析技术预测CDDO-Me与USP2a的结合情况,采用细胞热迁移实验(cellular thermal shift assay,CETSA)检测CDDO-Me与3种TNBC细胞株内USP2a蛋白的结合情况。通过Western blotting检测USP2a的底物β连环素(β-catenin)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)蛋白水平以及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3(caspase3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1]的变化。利用细胞活性检测试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)检测CDDO-Me对TNBC细胞增殖的影响。MDA-MB-468细胞瞬时转染pLVX(pLVX组)或pLVX-USP2a(pLVX-USP2a组)质粒,经CDDO-Me处理后,采用Western blotting检测β-catenin和TRAF6的蛋白水平,流式细胞术检测细胞周期以及台盼蓝拒染法检测活细胞数。结果·CDDO-Me在体外可以抑制USP2a活性,50%抑制浓度为3.84μmol/L。分子对接分析结果显示,CDDO-Me可以和USP2a的His456残基之间形成氢键,和Phe409、Tyr514残基之间具有疏水相互作用。CETSA实验结果显示,CDDO-Me能够和3种TNBC细胞中的USP2a蛋白结合。Western blotting结果显示,CDDO-Me可以下调USP2a底物β-catenin和TRAF6的蛋白水平,而相同浓度的CDDO-Me处理USP2a过表达的MDA-MB-468细胞,发现β-catenin和TRAF6蛋白水平未出现明显降低。CDDO-Me呈剂量依赖性抑制TNBC细胞的增殖,使细胞发生caspase3活化和PARP1的剪切并且导致细胞出现S期和G2/M期阻滞。与pLVX组相比,pLVX-USP2a组活细胞数目更多,细胞也未出现周期阻滞。结论·CDDO-Me可以抑制TNBC细胞中USP2a的活性,并且抑制TNBC细胞的增殖,诱导其凋亡。

调节维甲酸受体稳定性的化合物细胞筛选体系的建立

目的·构建可用于发现调节维甲酸受体(retinoic acid receptors,RARα)蛋白稳定性的化合物的细胞筛选体系。方法·对pMSCV质粒进行改造,插入绿色荧光蛋白(EGFP)-RARα融合基因和红色荧光蛋白(Ds Red)基因,两者之间以内部核糖体结合位点(IRES)序列分隔;构建成功的质粒稳定转染急性早幼粒细胞白血病细胞NB4,流式细胞术分析全反式维甲酸、丙戊酸钠、阿糖胞苷、来那度胺、依托泊苷、孟鲁司特纳及藤黄酸处理细胞后EGFP与DsRed的荧光信号的变化,间接反映RARα蛋白表达水平;并通过Western blotting实验进一步验证阳性化合物对RARα蛋白水平的影响。结果·成功构建了蛋白稳定性双荧光筛选体系,并发现丙戊酸钠可有效使RARα蛋白的表达水平稳定。结论·双荧光筛选系统可用于调节RARα蛋白稳定性的化合物的筛选。丙戊酸钠是一个新的稳定RARα的化合物。该方法对建立稳定其他蛋白的化合物筛选系统具有参考价值。

磷脂爬行酶1(英文)

磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1,PLSCR1)属于Ca2+结合的棕榈酰化II型膜蛋白,而非棕榈酰化的PLSCR1蛋白可定位于细胞核内,并与基因组DNA序列结合。最初的研究显示,PLSCR1参与细胞膜磷脂跨膜活动。随后的研究发现多种细胞因子如干扰素、表皮生长因子等和白血病细胞分化诱导剂如全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)、佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)等也能够调节PLSCR1的表达。尤其重要的是,PLSCR1蛋白可与多种蛋白如c-Abl、EGFR、c-Src、PKCδ和onzin等相互作用,提示PLSCR1在细胞信号传递中的作用。越来越多的证据表明PLSCR1的确参与细胞生长、分化、凋亡过程,并可能与肿瘤尤其与白血病发病学存在关系。

间隙连接蛋白-43的表达调控及其功能

细胞间间隙连接通讯(G JIC)是相邻细胞之间的信息和能量物质交换的重要基础。作为G JIC重要成员之一的connexin43(Cx43)基因在转录和翻译水平受到机体的严密调控。相应地,除了调节G JIC外,Cx43也通过影响细胞增殖、分化和凋亡过程参与多种疾病尤其是肿瘤的发生和发展过程。

低氧诱导因子-1α对KLF5表达调控的研究

目的探索低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对转录因子KLF5的表达调控及其在细胞增殖中的作用。方法用低氧(1%O_2或低氧模拟物CoCl_2)处理293T细胞,通过q PCR和Western blotting检测HIF-1α、KLF5的m RNA和蛋白水平。用sh RNA抑制HIF-1α的表达,再用低氧处理293T细胞后检测KLF5的表达水平。在293T细胞中过表达HIF-1α-P2A质粒,然后检测其对KLF5基因启动子驱动的luciferase及KLF5表达水平的影响。在HIF-1α-P2A过表达的293T细胞转染sh KLF5,通过CCK8检测细胞的增殖情况。共同转染KLF5和HRE-luciferase质粒,通过荧光素酶报告系统检测KLF5表达对HIF-1α转录活性的影响。结果 q PCR和Western blotting显示低氧可以稳定HIF-1α蛋白,同时在转录水平增强KLF5的表达;sh RNA抑制HIF-1α表达可以抑制低氧诱导的KLF5表达上调,并且过表达外源性HIF-1α可以直接结合KLF5基因的启动子区并上调KLF5的表达;尽管单独过表达HIF-1α-P2A或者抑制KLF5的表达并不影响细胞增殖,但两者同时存在时可以明显促进细胞增殖;KLF5过表达可以明显抑制HIF-1α的转录活性。结论 KLF5是HIF-1α的直接靶基因,HIF-1α在转录水平调控KLF5的表达,而KLF5可能通过抑制HIF-1α的转录活性从而抑制HIF-1α的促增殖作用。

RAS相关的C3肉毒素底物1在胃癌中高表达并促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探究RAS相关的C3肉毒素底物1(RAC1)在胃癌中的表达及其与临床病理学特征的相关性,并观察RAC1对胃癌细胞的增殖、迁移等生物学特性的影响。方法:使用免疫组织化学染色方法研究RAC1在胃癌中的表达情况。分别使用χ2检验及Kaplan-Meier生存分析的统计学方法分析RAC1的表达与胃癌临床病理学的特征及预后的相关性。并探究高表达RAC1在体外实验中对胃癌细胞生长、迁移、侵袭的影响。结果:RAC1在胃癌组织中高表达,且不同分化程度、有无局部侵袭、淋巴结转移和不同Lauren’s分型间均有差异(均P<0.05)。RAC1高表达预示了胃癌患者的不良预后。在胃癌细胞中诱导RAC1高表达后发现其在体外促进胃癌细胞的生长、迁移及侵袭(均P<0.05)。使用特异性抑制剂抑制RAC1表达后发现,胃癌细胞生长、迁移及侵袭的生物学功能也受到相应的抑制(均P<0.05)。结论 :RAC1与胃癌的侵袭性相关且是预后不良的指标。体外实验结果也进一步证实了RAC1高表达与胃癌细胞的侵袭性相关,鉴于其在胃癌生长及进展中所起的重要作用,RAC1可作为胃癌治疗的潜在靶点。

活性小分子化合物和白血病:化学生物学研究

近10年来，以靶标特异的活性小分子化合物为探针研究重要细胞生命活动规律为主要目的的化学生物学（chemical biology）得到快速发展，也大大地推动了疾病尤其是恶性肿瘤的分子发病学研究和靶向治疗的进步。白血病是一类获得性体细胞突变所致的造血细胞恶性肿瘤，发病率占据恶性肿瘤的前10位。显然，开展白血病的发病学和治疗学研究非常重要。