兔阴囊原位构建组织工程化睾丸假体的实验研究

目的探讨以HDPE-PGA复合支架接种兔耳软骨细胞后,于兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体的可能性。方法取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备HDPE-PGA复合支架,细胞-支架复合物体外培养2w。摘除单侧兔睾丸后即时将经体外培养的细胞-支架复合物植入阴囊原位,术后3m将兔处死取材。单纯支架植入为对照组。标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、GAG含量检测。结果实验组取材标本经检测具有预制形态与体积,有新生软骨组织产生,软骨组织呈岛状分布,其间有不同程度的纤维组织长入及炎性细胞浸润。对照组无软骨形成。结论兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体具有预制形态与体积、结构与组织学形态良好。

组织工程研究进展

各种原因导致的组织、器官缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因,组织、器官缺损的修复和功能重建是医学领域面临的挑战。组织工程学的建立和发展,改变了传统的"以创伤修复创伤"的组织移植治疗模式。从人体获取少量自体组织,提取种子细胞并经过体外扩增后种植到支架材料上,经过体外培养形成工程化组织后再植入体内,修复相关组织缺损并恢复原有功能。这样的组织再生模式可以真正实现无创或微创的组织器官再生和功能重建。围绕种子细胞、生物材料、组织构建等组织工程基本要素,以组织构建为核心,开展了包括骨、软骨、肌腱等多种组织构建和大动物组织缺损修复的研究,取得了一系列重要进展,并成功开展了组织工程骨的小规模临床应用。这些研究成果,证实了组织工程的广阔应用前景,奠定了向临床应用的基础。该成果于2008年荣获国家科技发明二等奖。

激光打孔脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程气管软骨

目的探索激光打孔脱细胞基质诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)于动物体内构建组织工程气管软骨的可行性。方法应用激光打孔联合脱细胞技术制备激光打孔脱细胞基质(LDTM)作为支架材料。抽取兔骨髓,分离培养BMSCs,接种于LDTM支架后植入兔皮下。体内培养12周后,行大体观察、组织学检测、生物力学及生物化学定量检测。结果细胞均匀分布在激光微孔和支架表面,并且该复合物能够较好地维持原始的管状结构,形成了富有弹性的瓷白色软骨样组织。HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织形成。Safranin-O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学和生物化学检测显示新生气管组织均接近正常气管组织。结论 LDTM可以促进软骨再生并在动物体内诱导BMSCs构建组织工程气管软骨。

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。

不同体外诱导时间对BMSCs成软骨分化的组织学特性影响的研究

目的探索体外不同时间的成软骨诱导,对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的组织学特性的影响。方法以猪第2代BMSCs为种子细胞,以聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)为支架,体外构建直径12 mm,厚3 mm的圆盘状复合物,联合应用TGF-β1(10 ng/mL)、IGF-I(50 ng/mL)及地塞米松(40 ng/mL),体外分别诱导1周和4周,并以未经诱导的BMSCs和软骨细胞为对照,分析和比较不同诱导时间对BMSCs体外成软骨分化的影响。结果体外诱导4周的BMSCs-PGA/PLA复合物的组织学结构明显较只诱导1周的致密,软骨特异性基质(如蛋白多糖、Ⅱ型胶原等)表达水平明显高于诱导1周的。结论体外诱导时间对BMSCs软骨定向分化具有重要影响,延长诱导时间可明显促进复合物成熟并增加其软骨基质分泌。

软骨形态发生蛋白1诱导犬真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的实验研究

目的探讨软骨形态发生蛋白1(Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1)诱导体外培养的犬真皮成纤维细胞(Dermal fibroblasts,DFs)向软骨细胞表型分化的可行性。方法应用CDMP1细胞诱导液对体外扩增至第4代的犬DFs进行诱导培养,观察细胞的形态变化,以免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中软骨特异蛋白的表达情况。结果诱导培养6 d后,实验组部分DFs呈星形或多角形,免疫组化染色显示有软骨特异的II型胶原分泌,RT-PCR检测也表明有Ⅱ型胶原、aggrecan和SOX9表达。但是诱导培养10 d后,均转为阴性。结论 CDMP1可以诱导犬DFs向软骨细胞表型分化,有可能成为组织工程化纤维软骨的种子细胞。

关节软骨生化结构及其与力学性能关系研究进展

关节软骨缺损在临床很常见。由于血液供应差及应答创伤反应的未分化细胞群相对缺乏,软骨缺损很难自行修复。组织工程技术可将具有软骨形成潜能的细胞接种到生物可降解材料上形成细胞-支架三维复合物,该复合物在体外或体内可形成组织工程化软骨,有望解决软骨缺损修复这一临床难题。要构建具有完整结构和稳定功能的组织工程化软骨,必须深入了解软骨的形态结构、功能及其关系。文章就正常及组织工程化关节软骨的生化结构及其与生物力学性能的关系进行综述。

糖尿病裸鼠的皮肤组织改变及其与创面愈合的相关性

目的研究糖尿病裸鼠的皮肤组织改变及其与皮肤创面愈合的相关性。方法采用150 mg/kg链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立糖尿病裸鼠模型。对正常对照组裸鼠(n=20)和诱导成模后4周的糖尿病裸鼠(n=20)分别切取背部直径为1.8 cm的全层皮肤。采用苏木精-伊红(HE)染色,观察裸鼠皮肤的组织学改变并测量真皮层和表皮层厚度。采用苦味酸天狼猩红染色并分析相对胶原含量;应用氧化酶法测量皮肤组织糖含量。于术后第3、5、7、14和21天观察创面的愈合率。结果糖尿病组裸鼠的皮肤真皮层和表皮层厚度较正常对照组明显变薄,真皮层相对胶原含量也明显少于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。糖尿病组裸鼠的血糖浓度和皮肤糖含量均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01);皮肤组织糖含量与血糖浓度呈正相关(r=0.951,P<0.01)。糖尿病组裸鼠在术后第3、5、7、14和21天的创面愈合率显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论应用STZ诱导的糖尿病裸鼠模型的皮肤组织改变明显,这些改变可能与局部糖基化终末产物蓄积,导致糖尿病皮肤创面不易愈合有关。

脂肪干细胞分化潜能研究进展

组织工程技术的兴起和迅猛发展为组织或器官缺损的修复重建带来了新的治疗途径，并已逐渐成为目前最有前景的生理性修复技术。然而。种子细胞来源不足、功能老化等问题严重限制了组织工程技术的进一步发展与应用。成体干细胞（adult stem cells．ASC）因分布广、增殖力强且具有多分化潜能而成为当前组织工程种子细胞研究的重点。ASC可来源于骨髓、脂肪、皮肤、肌肉、角膜等各类组织。其中以骨髓基质干细胞（Bone marrow stem cells，BMSC）研究最多，应用最广。近年来．随着研究的不断深入，脂肪干细胞（Adipose—derived stem cells，ADSC）逐渐被人们发现并迅速进入种子细胞研究领域，因其体内分布广，取材创伤小，细胞获得量大，还能对病人进行体形重塑等优点。最近已成为新的研究热点。

睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究

目的改进Leydig干细胞的分离及纯化方法,观察其生物学特性并进行鉴定。方法通过胶原酶消化、差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法,从大鼠睾丸内获得Leydig干细胞。以条件培养液进行培养,采用CCK法测定增殖能力。通过PDGFRα、LIFR及3β-HSD免疫组织化学染色鉴定Leydig干细胞。经定向诱导分化后,检测Leydig细胞的睾酮分泌能力。结果每个睾丸约可获得83 000个干细胞,经免疫组织化学染色分析,PDGFRα阳性率为(98.0±0.8)%。在条件培养液中培养的SLCs增殖明显,在1个月内能稳定维持其干性而未向Leydig细胞系分化。免疫组织化学染色结果表明,PDGFRα、LIFR阳性表达,3β-HSD为阴性表达。Leydig干细胞在含有T3和HCG的培养液中培养后,第5天即可测到睾酮分泌,分化后的细胞3β-HSD+。结论由差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法能获得纯化的PDGFRα+/LHR-细胞,这些细胞符合SLCs所必须具有的特征。采用该方法获取SLCs,操作简便,细胞损伤小并且获取纯度高。

JNK抑制剂对软骨细胞外基质合成的作用研究

目的探索JNK抑制剂(SP600125)对软骨细胞外基质合成的影响。方法获取、培养兔耳软骨细胞,通过CCK-8法测定SP600125对细胞增殖的影响。将兔耳软骨细胞接种于PGA/PLA支架,构建细胞-支架复合物,并随机分为实验组与对照组。实验组将细胞-支架复合物置于含有10%FBS和SP600125的DMEM中培养,对照组在含有10%FBS的DMEM中培养。体外培养8周后,RT-PCR检测IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGF-β1等软骨特异性基因的表达,并行HE染色与Safranin-O染色。结果 CCK-8法检测显示,相较对照组,实验组软骨细胞的增殖明显增强;体外培养8周后,实验组软骨特异性基因IGF、COLⅡ、COLⅨ、TGFβ1的表达显著下降(P<0.05);组织学观察显示,实验组软骨陷窝的成熟度低,细胞外基质分泌减少。结论 SP600125可降低软骨细胞外基质的合成。

CD204阴性人脂肪来源细胞体外成软骨潜能的初步研究

目的比较CD204+和CD204-两种人脂肪来源细胞的干细胞特性和体外诱导成软骨的能力。方法分离培养人脂肪来源细胞并进行流式细胞分选,分别获得CD204+和CD204-两种细胞。将这两种细胞培养扩增至第2代,观察其形态学特点;成脂、成骨定向诱导分化,油红O染色、茜素红染色定性;同时将两种细胞进行pellet成软骨诱导分化,比较体外诱导成软骨的能力,并以HE、Safranin O和Ⅱ型胶原免疫组化染色等进行鉴定。结果经流式细胞分选,脂肪来源细胞中CD204表达阳性率约为10%。分选后的CD204+和CD204-细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长,但CD204-细胞具有更强的增殖能力。成脂诱导10 d后,两组细胞油红O染色均可见胞浆内有大量红染脂滴,但CD204+细胞具有更强的成脂潜能。成骨诱导2周后,两组细胞茜素红染色均可见钙结节红染,而CD204-细胞具有更强的成骨潜能。同时,细胞pellet成软骨诱导4周后,大体观可见CD204-细胞组pellet形成白色透明样软骨成分,而CD204+细胞组pellet外观微黄。HE和Ⅱ型胶原免疫组化染色均显示CD204-组pellet可见成熟软骨陷窝形成,Safranin O染色显示CD204-组软骨特异性细胞外基质沉积;而CD204+细胞组pellet则呈纤维化改变。结论脂肪组织来源的CD204-细胞具有干细胞的生物学特点,且有良好的成软骨潜能,可以成为软骨组织工程良好的种子细胞来源。

快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法

目的研究在体外快速获得骨髓基质干细胞及纯化的方法。方法采用流式细胞仪筛选法获得CD45-、CD90+原代细胞,复合胶原酶差速消化逐级传代、纯化;对第3代(P3代)细胞进行脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞三向诱导;2～4周后,分别行oilred’O、Safranin’O和茜素红染色,倒置显微镜下观察诱导结果。结果经流式细胞仪初筛和复合胶原酶差速消化,传代至P3代,细胞形态已呈现均一性。向脂肪细胞诱导后第4周,oilred’O染色见细胞内大量红染的脂滴;向软骨细胞诱导后第4周,Safranin’O染色见多数切片呈阳性,细胞团块中存在大量软骨特异性的陷窝样结构;向骨细胞诱导后第4周,茜素红染色发现肉眼可见广泛散在的红色阳性钙结节。结论本研究所采用的流式细胞仪初筛和复合胶原酶差速消化法,可快速获得高纯度的骨髓基质干细胞。

化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果

目的研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况。方法兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5-7d,观察细胞发育与囊胚形成情况。结果钙离子载体A23187激活处理5min后,继续在2.0mmol/L6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0h的卵裂率最高（58.82%,20/34）,并有15%（3/20）的囊胚发育率。透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20min后,均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20min的激活率和卵裂率最高,分别为58.33%（28/48）和63.64%（28/44）。结论兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关。化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响。

Tenomodulin基因转染对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用

目的研究过表达Tenomodulin(TNMD)对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用。方法体外培养NIH3T3和C3H10T1/2细胞系,利用脂质体法在两种细胞系中分别转染pCAGGS空载体和pCAGGS-TNMD表达载体,G418进行稳定筛选。RT-PCR确认成功转染后,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,同时定量PCR检测肌腱相关基因的表达情况。结果两种细胞系转染后细胞形态均无明显改变。基因水平上,NIH3T3细胞过表达TNMD后,collagenⅥ和biglycan显著降低,collagenⅠ没有显著差别。而在C3H10T1/2细胞中,collagenⅠ和biglycan显著升高,collagenⅥ没有显著差别。结论过表达TNMD对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系的细胞形态没有影响,但能影响肌腱相关基因的表达情况。

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较。方法酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养。通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力。结果组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprotvs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprotvs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性。结论与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞。

低氧培养促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖

目的小鼠骨髓间充质干细胞(Murine bone marrow stem cells,mBMSCs)体外培养增殖相对缓慢,细胞表型会逐渐丧失。本研究采用低氧培养观察mBMSCs的增殖和表型维持情况,以期寻找一种更简便和快速扩增mBMSCs的方法。方法用低氧浓度(4%O_2)和常规氧浓度(20%O_2)培养、扩增mBMSCs,观察比较两种氧浓度培养的细胞增殖速度、细胞形态和细胞周期分析等。结果低氧浓度(4%O_2)促进mBMSCs增殖,同代次细胞倍增时间明显短于常规氧浓度(20%O_2)细胞;相比低氧浓度(4%O_2),常规氧浓度(20%O_2)培养的细胞更容易发生去分化。在细胞周期分析中,低氧浓度培养的mBMSCs处于复制期的比例高于常规氧浓度培养细胞的比例。结论低氧(4%O_2)培养可以促进mBMSCs增殖,是一种简便的体外迅速扩增mBMSCs的较好方法。

自体骨髓间充质干细胞复合β-磷酸三钙修复犬下颌骨节段缺损

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合β-磷酸三钙(β-TCP)构建的组织工程骨修复犬下颌骨节段缺损的可行性方法体外成骨诱导犬BMSCs,将第2代细胞复合β- TCP后修复6只犬右侧3cm的下颌骨节段缺损；6只犬以单纯β-TCP植入作为对照,术后4,12,26,32周分别通过影像学、大体形态、组织学和生物力学检测判断骨缺损的修复效果。结果诱导后第2代细胞已具成骨活性。4～26周X线片示实验组新骨形成增加,密度增高,对照组则材料吸收形成明显阴影区,只有少量骨痂。32周实验组骨愈合良好,有较多板层骨；对照组为纤维性愈合骨不连,骨密度检测实验组显著高于对照组。实验组力学强度与正常下颌骨差异无统计学意义。结论自体成骨诱导BMSCs复合β-TCP形成的织工程骨可良好修复犬下颌骨节段缺损。