基于基因及调控区进化保守性评估细胞和组织发育潜能的定量分析

目的在DNA序列的保守度层面探讨物种进化与发育之间的关系及其内在规律。方法分析编码基因的氨基酸序列在100个物种中的保守程度,并建立保守率(conservation rate,CR)这一量化基因进化保守程度的指标,进一步使用胚胎干细胞通路特征基因验证保守率与发育潜能的关系。分析早期三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)及其对应的成熟器官(肝脏、心脏和大脑等)的转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)数据,寻找差异表达基因,研究其保守性特点。收集人类早期胚层和成熟器官H3组蛋白第27位赖氨酸乙酰化(histone H3 acetylated at lysine 27,H3K27ac)这一增强子表观遗传标志物的染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)数据,寻找增强子位点,使用ROSE程序鉴定各种细胞和组织中的超级增强子(super enhancer,SE)。使用基因通路富集分析研究超级增强子调控的基因与对应的细胞特征的身份相关性,以明确所鉴定的超级增强子是否符合已有研究报道的特点。使用PhastCons程序计算非编码调控区的DNA保守性评分(conservation score,CS),研究其与发育潜能的关系。结果在基因编码区,成功建立保守率这一对基因保守程度进行量化的指标。早期三胚层和成熟器官的基因表达数据分析显示:保守率越高的基因与干性和早期发育过程相关性越大,基因保守率指标能区分出发育前后的组织差异。在基因非编码区,发现调控区的保守性也与发育具有相关性:发育早期三胚层的超级增强子序列的保守性评分显著高于对应的成熟器官的超级增强子序列;但细胞特异的普通增强子(typical enhancer,TE)没有呈现出这样的趋势。结论随着发育进行,在基因编码区特异表达的基因在进化中的保守率下降,非编码调控区的超级增强子DNA保守性评分下降。

基于转录组学分析miR-34b/c与miR-449对小鼠输出小管结构与功能的影响

目的:研究miR-34b/c、miR-449在维持输出小管正常结构与功能中发挥的作用,探索miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠不育的分子机制。方法:HE染色对小鼠输出小管形态进行观察;利用转录组测序技术对野生型小鼠和miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠输出小管基因表达进行分析,从中筛选出miR-34b/c、miR-449可能的靶基因与差异表达基因进行联合分析;qRT-PCR法验证测序结果。结果:双敲除小鼠输出小管形态异常;与野生型小鼠相比,双敲除小鼠输出小管中参与纤毛等结构形成以及水、离子、蛋白质转运等活动的基因表达显著下降。结论:miR-34b/c、miR-449的缺失导致双敲除小鼠输出小管结构异常,输出小管纤毛运动与重吸收功能障碍,导致双敲除小鼠不育。

SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用

目的·探究转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)体外分化过程中的不同作用。方法·在hESC中,通过蛋白质印迹法(Western blotting)检测SMAD2和SMAD3在分化过程中的蛋白表达水平。通过CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术构建SMAD2敲除(SMAD2 knockout,SMAD2KO)和SMAD3敲除(SMAD3 knockout,SMAD3KO)的细胞系。利用免疫荧光染色检测SMAD蛋白丢失对多能性因子八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2),神经外胚层(neuroectoderm,NE)标志因子配对盒因子6(paired box 6,PAX6)和性别决定区Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1,SOX1)以及中内胚层(mesendoderm,ME)标志因子SOX17的表达影响;同时使用流式细胞术鉴定SMAD2敲除或SMAD3敲除对NE标志因子PAX6以及ME标志因子SOX17、脱中胚蛋白(eomesodermin,EOMES)和C-X-C模体趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表达的影响。在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达SMAD2和SMAD3质粒,通过Western blotting检测SMAD2和SMAD3蛋白回补的效果,并利用实时定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测SMAD蛋白回补后对分化过程中的ME关键因子EOMES、叉头框转录因子A2(forkhead box A2,FOXA2)和GSC同源盒(goosecoid homeobox,GSC)表达的影响。结果·虽然SMAD2和SMAD3的蛋白序列较为相似,但是SMAD2才是hESC中主要表达的蛋白因子。免疫荧光染色结果表明,SMAD2敲除和SMAD3敲除并不会影响hESC多能性因子OCT4和SOX2的表达;同时流式细胞术发现,SMAD蛋白的缺失也不会影响NE标志因子PAX6和SOX1的表达。SMAD3敲除对hESC向ME分化没有显著的影响,而SMAD2敲除严重阻碍了hESC表达ME标志因子SOX17、EOMES和CXCR4。通过qRT-PCR检测显示在SMAD2KO细胞中过表达外源性SMAD2可以有效地恢复ME基因EOMES、FOXA2和GSC的表达,而在SMAD3KO细胞中回补SMAD3对这些ME基因的表达无影响。结论·SMAD2和SMAD3在hESC向ME分化过程中的调控作用不同。SMAD2而非SMAD3是决定hESC表达ME基因的关键。

小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证

目的·构建野生型(wild type,WT)小鼠和miR-34b/c^(−/−)且miR-449^(−/−)双敲除(double knockout,dKO)小鼠输卵管上皮类器官的培养体系,并进行表型验证。方法·利用酶消化法和差速贴壁法分离纯化WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮细胞,并利用免疫荧光法鉴定得到的输卵管上皮细胞的纯度;通过计数和直径测量比较WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官数量、生长速度和生长大小;利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色和透射电子显微镜(透射电镜)对输卵管上皮类器官进行形态和结构观察;采用免疫荧光法观察并统计纤毛细胞和分泌细胞在WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官中的比例;采用免疫组织化学法、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting检测分泌细胞、纤毛细胞相关基因在输卵管上皮类器官中的表达。结果·分离纯化得到的输卵管上皮细胞纯度较高。与WT小鼠相比,dKO小鼠输卵管上皮类器官生长更快,体积更大,数量也更多;但dKO小鼠输卵管上皮类器官发育较慢,于培养28 d时才出现上皮内陷,而WT小鼠的类器官于培养16 d时已经出现。H-E染色和透射电镜结果显示输卵管上皮类器官呈现出与在体输卵管类似的结构。免疫荧光检测显示dKO小鼠输卵管上皮类器官的纤毛细胞显著减少而分泌细胞显著增多(均P<0.05)。免疫组织化学法检测结果显示,dKO小鼠输卵管上皮类器官的分子表达模式与在体输卵管组织基本一致,即纤毛细胞标志物乙酰化微管蛋白α(Ac-α-tubulin)、叉头框J1(forkhead box J1,FOXJ1)表达减少,分泌细胞标志物配对盒8(paired box 8,PAX8)表达增加;RT-qPCR结果显示dKO小鼠输卵管上皮类器官中Foxj1和微管蛋白β4A(tubulinβclassⅣa,Tubb4a)的mRNA水平均降低(均P<0.05),而Pax8 mRNA水平升高(P<0.05);Western blotting结果显示,dKO小鼠类器官中FOXJ1的蛋白表达水平显著降低,PAX8表达显著升高(均P<0.05)。结论·研究成功构建WT小鼠和dKO小鼠的输卵管上皮类器官培养体系,该体系可模拟小鼠在体输卵管的表型。

靶向前列腺特异性膜抗原的放射引导手术在前列腺癌治疗中的应用进展

前列腺癌是男性泌尿系统常见肿瘤,前列腺癌根治手术的技术更新是前列腺癌治疗领域中备受关注的热点。靶向前列腺膜特异性膜抗原的放射引导手术(PSMA-RGS)可在术中提高对于微小转移淋巴结的识别与清除能力,有助于改善初诊以及复发前列腺癌患者的治疗预后。当前,多种放射性标记的小分子抑制剂已被应用于PSMA-RGS中,而最近出现的插入式(DROP-IN)探头则推动了放射引导手术与微创腹腔镜下机器人辅助手术环境的整合。本文从放射标记靶向配体优化、手术技术的进步以及临床应用现状三个方面综述近年来PSMA-RGS用于前列腺癌治疗的研究进展。

过表达Foxj2对小鼠精子发生的影响及调控机制

目的:研究睾丸生殖细胞Foxj2条件性敲入小鼠(Stra8-cre;Foxj2tg/+小鼠)的生殖表型并鉴定转录因子FOXJ2的靶基因,探讨睾丸中过表达Foxj2对雄性生育的影响及作用机制。方法:基于Cre-loxP重组系统构建睾丸生殖细胞Foxj2条件性敲入小鼠模型(Stra8-cre;Foxj2tg/+小鼠);统计每窝产仔数以及卵母细胞胞浆注射精子(ICSI)后的受精率以观察雄鼠生育力;HE染色对睾丸、附睾形态进行观察;计算机辅助精子分析(CASA)检测精子浓度及运动能力;RT-qPCR、Western印迹、免疫组化观察连接蛋白43(Cx43)在睾丸中的表达及定位;ChIP-PCR、双荧光素酶报告基因验证FOXJ2与Cx43启动子区的结合。结果:Stra8-cre;Foxj2tg/+雄鼠每窝产仔数较对照组低,ICSI后的受精率较对照组低,生育力下降;睾丸重量及体积较同窝对照雄鼠减少近一半;HE染色显示生精小管中生殖细胞脱落,精母细胞及精子细胞大量减少;CASA结果显示附睾尾部精子浓度较对照组显著下降;RT-qPCR和Western印迹显示Stra8-cre;Foxj2tg/+雄鼠睾丸中Cx43转录水平和蛋白水平均升高;ChIP-PCR和双荧光素酶报告基因法检测发现FOXJ2可以与Cx43基因启动子区域直接结合。结论:FOXJ2过表达可能通过调控Cx43的高表达,导致Stra8-cre;Foxj2tg/+雄鼠精子发生障碍,生育力下降。

DNA损伤修复相关基因致原发性卵巢功能不全的研究进展

原发性卵巢功能不全(POI)是指女性在40岁之前即出现闭经并伴血清高促性腺激素及低雌激素水平,是导致女性不孕不育的重要原因之一。POI发病机制高度异质,可能病因包括染色体异常、基因突变、自身免疫异常、医源性及环境因素等,其中遗传学因素约占25%左右。在卵子发生的减数分裂过程中,会发生同源染色体配对、联会、重组、分离等过程,期间,DNA损伤修复机制发挥重要作用。近年来,越来越多的研究发现DNA损伤修复相关基因的异常与POI的发生有关,本文综述了与此相关的最新研究进展。

转录因子Foxj2在小鼠精子发生过程中的作用研究

精子发生包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂及精子形成3个过程,该过程涉及众多相关特异表达基因的精细调控。研究提示转录因子Foxj2表达于睾丸生殖细胞。为明确睾丸中过表达Foxj2对雄性生育的影响,本研究利用Cre-loxP重组系统构建了睾丸生殖细胞条件性敲入Foxj2的小鼠模型(Stra8-cre;Foxj2-cKI),发现Foxj2杂合敲入雄鼠生育率下降、Foxj2纯合敲入雄鼠不育。

miR-34b/c与miR-449对小鼠输出小管结构与功能的影响研究

输出小管正常的结构与功能对于精子向附睾的运送以及维持睾丸液的动态平衡具有重要作用,对雄(男)性生育力的维持具有重要意义。为探讨miR-34b/c、miR-449在维持输出小管正常结构与功能中发挥的作用及分子机制,本研究对小鼠输出小管形态学进行观察,发现从2周龄开始,双敲小鼠输出小管纤毛细胞数量较对较对照组减少,纤毛结构异常;1周龄时,双敲小鼠输出小管纤毛细胞的分化出现了障碍。与野生型小鼠相比,3周龄双敲小鼠输出小管上皮大量与细胞周期相关的基因表达水平上调。

内质网蛋白VAPA影响小鼠精子顶体生成的机制研究

目的探究内质网蛋白VAPA(Vesicle-associated membrane protein-associated protein A)对小鼠精子形成的影响。方法通过loxP-cre策略构建生精细胞特异的Vapa条件性基因敲除(Vapa CKO)小鼠模型;野生型和Vapa CKO成年雄性小鼠睾丸进行称重并统计分析;HE染色观察野生型和Vapa CKO成年雄性小鼠生精上皮形态;免疫荧光染色和透射电镜观察检测野生型和Vapa CKO成年雄性小鼠顶体的生成状况。结果生精细胞VAPA蛋白缺失时,小鼠睾丸重量明显减轻(P<0.0001);精子发生阻滞于圆形精子细胞,尤其是圆形精子细胞无法生成顶体。结论内质网蛋白VAPA参与小鼠的精子形成,并在顶体生成中发挥重要的作用。

髓鞘生成与再生的糖代谢调控

中枢神经系统的少突胶质祖细胞通过增殖、迁移、分化,产生少突胶质细胞,进而形成包绕轴突的髓鞘结构。髓鞘不仅确保了神经电信号的跳跃式传导,还通过分泌神经营养因子等物质给予神经元能量和营养支持,参与哺乳动物脑高级功能的建立和维持。髓鞘形成和再生需要消耗大量能量。葡萄糖作为首选能量来源,参与了ATP产生、氧化应激调控等关键生物学过程,在髓鞘的形成和再生中发挥了重要作用。基于现有研究,本文综述了葡萄糖代谢对髓鞘形成的调控作用,为髓鞘脱失及其相关的神经系统疾病的理解和治疗提供线索。

POMHEX可抑制小鼠精子运动和获能

目的探究抗肿瘤药物POMHEX对成熟小鼠精子功能的影响。方法将小鼠精子在体外暴露于POMHEX(0.1~100μmol/L),通过计算机辅助精液分析系统评估精子活动率和前向运动精子百分率;伊红-苯胺黑染色法检测精子存活率;荧光素-荧光素酶系统检测精子ATP水平;蛋白质印迹实验检测精子获能相关蛋白质酪氨酸磷酸化;考马斯亮蓝G250染色检测精子顶体反应。结果在不影响存活率的条件下,0.1μmol/L及以上浓度POMHEX可降低小鼠精子活动率(P<0.01)和前向运动精子百分率(P<0.05);1μmol/L及以上浓度可抑制小鼠精子ATP水平(P<0.01)和获能过程蛋白质酪氨酸磷酸化的增加。POMHEX虽然不影响小鼠精子的自发顶体反应,但在5μmol/L及以上浓度会抑制由钙离子载体A23187诱导的顶体反应(P<0.01)。结论抗肿瘤药物POMHEX在体外可抑制小鼠精子运动和获能,对小鼠精子造成生殖毒性。提示接受POMHEX治疗的患者可提前进行生育力保存。

高脂饮食诱导的肥胖对小鼠精子线粒体及活动力损伤的机制研究

目的探究高脂饮食诱导的肥胖引起C57BL/6小鼠精子线粒体损伤及活动力低下的作用机制。方法构建肥胖实验动物模型。采用计算机辅助精液分析仪(computer-assisted semen analysis, CASA)分析其生育力相关参数,包括精子活动力、前向运动精子百分数以及精子浓度;运用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)分析正常与肥胖小鼠的睾丸形态学结构,荧光探针JC-1和罗丹明123对小鼠精子线粒体进行染色,采用流式细胞仪分析两组精子染色后的平均荧光强度,最后使用Real-time PCR对两组小鼠精子线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的拷贝数进行分析。结果与正常野生型小鼠相比,肥胖小鼠的精子活动力、前向运动精子百分数明显减弱且睾丸形态存在异常,而精子浓度没有明显变化。进一步研究发现,与正常小鼠相比,肥胖小鼠的精子线粒体膜电位显著降低,但两者mtDNA拷贝数没有明显差异。结论肥胖能够引起精子线粒体功能损伤从而导致精子活动力及前向运动精子百分数低下,最终损伤雄性的生殖功能。

胰腺类器官技术的发展及应用

在人类生物学和疾病的研究过程中,动物模型扮演了重要的角色。但随着研究的深入,其局限性也逐渐凸显。新兴的人类类器官(organoid)技术较好地弥补了动物模型的不足。类器官主要是指由干细胞衍生出的3D多细胞微器官。它能在体外模拟组织器官自发的谱系分化与稳态维持,并具备类似于体内组织器官的生理功能。目前,类器官培养技术在很多器官(比如胃肠道、食管、肝、胆、脑和膀胱等)中都取得了较好的进展。胰腺是人体内唯一的一个既是外分泌腺又是内分泌腺的特殊脏器。因此,胰腺类器官技术的发展面临更大的挑战。目前,胰腺导管类器官和胰岛类器官技术日渐优化,但如何构建复合型胰腺类器官仍是当前研究的难点。该综述将主要回顾胰腺的发育过程、体外定向分化技术以及胰腺类器官模型构建与应用等最新研究成果,同时简要探讨胰腺类器官模型具有潜力的发展方向。