国家自然科学基金青年科学基金项目立项的影响因素分析——以上海交通大学医学院为例

目的·基于医学领域国家自然科学基金青年科学基金项目资助率低的现状,对项目申请人展开深入调查,定量分析项目立项的影响因素,为进一步提升项目申报质量、加强青年医学人才培养提供数据参考和决策依据。方法·采用横断面调查法,选取上海交通大学医学院各二级学院及13所附属医院在2020—2022年有国家自然科学基金青年科学基金项目申报经历的申请人进行问卷调查,以项目申请结果为因变量,以申请人基本情况和申报情况等为自变量,通过Logistic逐步回归模型建模与分析。结果·对921名项目申请者的分析结果显示,学历(OR=1.86,95%CI1.14~3.04)、毕业院校(OR=2.45,95%CI 1.47~4.08)、有较为充分的前期工作基础(OR=4.22,95%CI 2.44~7.29)、代表作平均影响因子(OR=1.10,95%CI1.04~1.17)、申请书自评总分(OR=1.06,95%CI1.04~1.08)是项目立项的主要影响因素。且项目获批者代表作平均影响因子和最高影响因子呈逐年递增的趋势。此外,青年医师和专职科研人员项目获批的影响因素不同,青年医师的毕业时间越长,获批率越低。结论·青年科学基金项目资助率低下,对科研成果的要求逐年提升,应注重前期积累,提高申请书撰写质量,并进一步采取措施,加强青年医学人才早期培养,完善分类培养举措,着力夯实研究基础。

抗PNAS-2单链抗体对白血病U937细胞凋亡的影响

目的观察抗PNAS-2单链抗体与PNAS-2抗原特异性结合的能力,并在此基础上探究其对急性单核细胞白血病U937细胞凋亡的影响。方法运用反转录病毒转染法将抗PNAS-2单链抗体表达载体pMIG-PNAS-2ScFv转入U937细胞(pMIG-PNAS-2ScFv组),同时设转染pMIG空载体(NC组)及未转染载体的U937细胞(U937组)为对照。流式细胞仪检测转染效率;激光共聚焦显微镜观察单链抗体表达情况及与靶抗原特异性结合的能力;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡;Western blotting观察PNAS-2表达及促凋亡因子caspase-3激活情况。结果成功将抗PNAS-2单链抗体编码序列转入U937细胞,所表达的单链抗体能与PNAS-2抗原特异性结合。与NC组和U937组相比,pMIG-PNAS-2ScFv组细胞凋亡率明显上升(P<0.05),活化型caspase-3表达增加,但PNAS-2含量并无变化。结论抗PNAS-2单链抗体能有效结合U937细胞内的PNAS-2抗原并有促进U937细胞凋亡的作用,其促凋亡机制可能与PNAS-2功能位点被封闭后功能失活而无法发挥抑凋亡作用有关。

铁代谢与细胞分化

铁是多种生命形式必需的营养元素之一,存在于铁卟啉化合物、铁硫蛋白、运铁蛋白等含铁化合物中。铁参与细胞内许多重要信号分子的调控,在细胞周期、分化、凋亡等生物过程中发挥重要作用。细胞内铁的代谢状态与细胞分化相关信号调控分子之间有着密切的关系,从而决定了细胞的分化方向。由于正常细胞与肿瘤细胞的铁代谢存在着差异,使得铁剥夺疗法也成为肿瘤治疗中的新途径。

基于小分子活性化合物的白血病细胞分化与凋亡信号机制

急性髓细胞性白血病(AML)是一种异质性的血液恶性肿瘤,也是发生在成年人中最普遍的急性白血病.过去20年间,对于AML的病理生理学的认识和治疗学等方面取得显著进展尤其是全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)的成功实践,为许多AML病人带来了生存希望.与此同时,以靶标特异的活性小分子化合物为探针研究重要细胞生命活动规律为主要目的的化学生物学手段,大大地推动了白血病的分子发病学研究和靶向治疗的进步.本文主要以本课题组的工作为重点,对过去10多年中,我国学者在相关研究工作中取得的一些进展作一总结和展望.

CD229在浆细胞疾病免疫分型中的应用价值

目的探讨CD229作为新的流式细胞术(FCM)浆细胞设门标志物的可行性。方法选取150例患者,其中浆细胞疾病110例、非血液病患者40例。采用FCM分析患者骨髓中浆细胞及其他细胞(淋巴细胞、粒细胞和单核细胞)CD229、CD138和CD38的表达并作比较,同时比较不同设门组合得出的浆细胞百分比。结果浆细胞CD229、CD138和CD38的平均荧光强度(MFI)分别为25.54(10.01~68.34)、30.59(4.77~88.94)和67.04(18.57~98.26),CV分别为69.2%(30.9%~110.4%)、96.5%(38.4%~221.0%)和42.8%(31.5%~110.2%)。浆细胞CD229的MFI明显高于其他细胞(P<0.05)。Pearson相关分析显示,CD229+CD38+CD45和CD229+CD45这2种设门组合得到的总浆细胞百分比与欧洲骨髓瘤网络(EMN)推荐的参考设门组合(CD38+CD45+CD138)呈明显正相关(r值分别为0.98、0.94,P<0.05)。异常浆细胞CD229的MFI与正常浆细胞比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论CD229是一种可靠的浆细胞设门抗体,可弥补CD38及CD138设门组合的不足,同时还能用于判断浆细胞的性质。

基于生物医学大数据寻找不孕症关键致病基因及通路

目的·通过整合不孕症遗传因素大数据,挖掘突变规律及相关致病基因。方法·根据全球蛋白资源数据库(Universal Protein Resource,Uniprot)蛋白类别对搜集的人类不孕症致病基因进行分类,统计分析临床病例中每类基因的突变频数。针对功能异常的氧化还原酶这一重要致病因素,进行功能和通路分析,观察通路的相关情况。于小鼠基因数据库(Mouse Genome Informatics,MGI)获取人类类固醇激素生成通路的小鼠同源基因及致病信息,寻找规律并结合基因互作分析评估其中的潜在基因。结果·不孕症致病基因里氧化还原酶类基因突变最常见,可能最易发生突变;其聚集于类固醇激素生成通路,发现潜在相关突变基因,并发现此通路醛酮还原酶家族1成员C3(aldo-keto reductase family 1 member C3,AKR1C3)是其中最可能的人类不孕症的潜在致病基因。结论·主要产生类固醇激素的氧化还原酶类致病基因在不孕症中突变最常见,可能包括AKR1C3。

糖酵解水平精细调控白血病起始细胞的命运决定

上海交通大学医学院细胞分化与凋亡教育部重点实验室郑俊克研究组通过建立新型白血病细胞代谢成像体系,揭示了白血病起始细胞(leukemia-initiatingcells,LICs)以糖酵解为主要能量来源的独特代谢特性,以及代谢状态决定LICs在特定骨髓微环境中的定位、归巢和对称分裂等关键细胞命运的新规律。该研究成果以“Metabolic imaging reveals a unique preference of symmetric cell division and homing of leukemia-initiating cells in an endosteal niche”为题于2019年4月发表于代谢领域国际著名学术期刊Cell Metab(封面文章)。

蛋白质组学在细胞凋亡研究中的应用

细胞凋亡是一种遗传决定的在多细胞生物生长发育和稳态维持中发挥重要作用的细胞程序性死亡.正常细胞中细胞凋亡程序受精细调控,而肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病的发生与细胞凋亡的失调密切相关,因此对其分子机制的研究备受关注.在过去的20多年研究中,发现很多凋亡相关的蛋白质被翻译后机制调控,包括蛋白质剪切、转位、蛋白质相互作用和各种翻译后修饰等,这些正是蛋白质组学的研究范畴.近年来,蛋白质组学技术飞速发展,并与遗传学和化学生物学等学科交叉,推动了功能蛋白质组学和化学/药物蛋白质组学的发展,并被迅速地应用于细胞凋亡研究领域,有对细胞凋亡研究产生重要影响的潜力.本文综述了近年来本实验室及国际上运用蛋白质组学技术和策略研究细胞凋亡的主要进展,同时展望了蛋白质组学在凋亡研究领域的方向和挑战.

Sirtuins在慢性肾脏疾病发生、发展中的作用

慢性肾脏疾病的发病率呈明显上升趋势,而衰老是慢性肾脏疾病发病的一个危险因素。Sirtuins蛋白家族是一类高度保守的NAD+依赖性去乙酰化酶,在热量限制、寿命调控以及多种代谢疾病中起重要作用。位于细胞核中的SIRT1和SIRT6可通过对组蛋白和转录调控因子去乙酰化调控基因表达,从而抑制慢性肾脏疾病患者肾脏中的细胞凋亡、炎症和纤维化,同时也可调节细胞应激反应、脂质代谢、自噬、血压和钠平衡。而位于线粒体的SIRT3可调节多种线粒体内酶的活性,从而参与慢性肾脏疾病的发生、发展。本文就Sirtuins蛋白在慢性肾脏疾病中的作用及机制的研究进展进行综述。

低氧、低氧诱导因子-1和白血病细胞分化

低氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞适应低氧反应的主要转录因子,由氧敏感的HIF-1α和组成性表达的HIF-1β组成.系列研究表明,低氧是肿瘤的重要微环境.相应地,HIF-1在实体瘤的发展和转移过程中发挥重要作用.本实验室研究显示,低氧通过HIF-1的转录非依赖功能,即与造血细胞分化相关的转录因子C/EBPα和Runx1/AML1等相互作用,并增加其转录活性,诱导急性髓细胞性白血病细胞分化.本文就低氧和HIF-1在白血病细胞分化中的作用作一综述.

高通量药物筛选模型的研究进展

作为高通量筛选系统的核心,筛选模型在研究深入与技术进步的推动下已得到较大发展与广泛应用。文章从分子、细胞和动物水平三个层面介绍高通量药物筛选模型的研究状况及应用,并对其优缺点与相关机制进行阐述。

Z突变α_1-抗胰蛋白酶缺乏症的研究进展

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(Serpin),是人血浆中最重要的蛋白酶抑制剂,能抑制多种蛋白酶,从而抑制组织的降解。经典的α_1-AT缺乏症由Z突变(Glu342Lys)引起,该突变导致蛋白在肝细胞内形成多聚体并聚积,引起肝细胞损伤,同时由于血浆中该蛋白浓度的减少,破坏了蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间的平衡,故可引起肺气肿和新生儿肝炎等疾病。该文主要从α_1-AT的分子结构、基因多态性,及其相关疾病的治疗等方面概述Z突变所致的α_1-AT缺乏症的致病机制和相关预后的研究进展。

SIRT2在糖脂代谢调节中的作用

Sirtuins是一类进化上高度保守,NAD^+依赖的去乙酰化酶家族。Sirtuins(SIRT1-SIRT7)可通过不同的机制和作用靶点参与衰老、代谢,应激反应、炎症反应、肿瘤形成等生理或病理生理过程,其中SIRT2主要分布于胞质和细胞核中,可以通过对不同的底物去乙酰化,从而调节底物的活性,参与机体一系列生理病理过程。本篇综述主要讨论了SIRT2的表达调控以及在糖脂代谢过程中的作用。

嗜酸乳杆菌ATCC4356 S-层蛋白的克隆、表达和纯化

目的克隆嗜酸乳杆菌S层蛋白的编码基因,使其原核表达并纯化表达产物。方法对嗜酸乳杆菌S层蛋白(S-layer protein)基因进行提取和扩增,连接pET-SUMO3表达载体并转入大肠杆菌内使其表达;采用镍柱亲和层析技术对S层蛋白进行提取及纯化,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证表达产物。结果嗜酸乳杆菌ATCC4356的S层蛋白编码基因(1 263 bp)被克隆,且与相关基因有98%同源性。SDS-PAGE及Western blotting证明,重组融合蛋白在细菌中能够高效表达且部分融合蛋白可经亲和层析及酶切去除融合标签获得重组S-层蛋白(43 0000 Da)。结论通过获得嗜酸乳杆菌S-层蛋白编码基因的方法可实现其原核表达,并得到纯度较高的S层蛋白,为后续的生物学功能研究奠定了基础。

重组人亲环蛋白CypB的制备及活性鉴定

目的·构建人源亲环蛋白B(hCypB)的表达载体,通过原核表达体系制备有活性的hCypB。方法·通过双酶切法将编码hCypB基因构建到p GEX-6p-1表达载体中,采用亲和层析法一步纯化hCypB,最后通过GST-pulldown验证过表达的hCypB的活性。结果·经DNA测序验证,成功构建了hCypB的表达质粒。通过GST柱纯化可以从1 L过夜诱导的大肠埃希菌菌液中获得26 mg,纯度达到90%的GST-hCypB融合蛋白,且GST-pulldown试验证明该重组蛋白可以与脯氨酸-3-羟化酶1(P3H1)及软骨相关蛋白(CRTAP)形成三元复合物。结论·利用该实验方法可以在短期内获得大量高纯度、有活性的人源亲环蛋白CypB。

重组人源抑制型受体TIGIT在大肠埃希菌中的制备及其作用特性研究

目的·在大肠埃希菌中制备人源GST-TIGIT融合蛋白并探究其与具核梭杆菌(Fn)互相作用特性。方法·对人源免疫调节蛋白TIGIT的基因进行扩增,重组到p GEX4T2表达载体中并转入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达融合蛋白;利用GST亲和层析方法纯化GST-TIGIT融合蛋白;采用特异性黏附试验检测GST-TIGIT融合蛋白与Fn的相互作用。结果·GST-TIGIT融合蛋白在大肠埃希菌中成功表达并利用GST亲和层析柱得到纯化蛋白;GST-TIGIT融合蛋白可特异性地结合于Fn表面,但与嗜酸乳杆菌结合较弱。结论·通过原核表达系统得到有活性的人源GST-TIGIT融合蛋白,并初步证明了其与Fn的黏附作用,为后续研究TIGIT蛋白与Fn特异性相互作用的机制奠定了基础。

重组大鼠α2巨球蛋白的表达、纯化及结晶

目的·获取高纯度的大鼠α2巨球蛋白(Rα2M),并对蛋白结晶进行筛选,以期获取高分辨率衍射数据,为后续结构生物学研究奠定基础。方法·将Rα2M基因克隆到真核表达载体p CEP4中,使用PEI介导的瞬时转染方法在HEK293EBNA细胞中表达重组蛋白Rα2M。采用阴离子柱交换层析和镍柱亲和层析技术从表达培养基中提纯Rα2M,对纯化蛋白进行结晶筛选和优化。结果·经纯化后,得到相对分子质量约为180 000的重组蛋白Rα2M的全长蛋白,以及被切割后的大片段和小片段。通过结晶筛选和优化后,得到了Rα2M的蛋白晶体。结论·获得了可用于晶体衍射的Rα2M蛋白晶体,为后续的结构解析奠定了基础。

一例遗传性骨髓衰竭综合征中RTEL1基因新突变的研究

本研究旨在探究端粒酶RTEL1(regulator of telomere length 1)突变导致遗传性骨髓衰竭综合征发生的机制以及RTEL1的生物学功能.本研究基于临床上一例男性儿童先天性角化不良患者展开,通过对患者外周血样本进行外显子测序确定存在RTEL1突变.我们成功构建了过表达野生型RTEL1(RTEL1-WT)以及突变型RTEL1(RTEL1-MUT)的293细胞系.通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)探究该突变对细胞增殖的影响,并发现RTEL1-MUT的表达影响细胞的增殖.通过免疫沉淀以及质谱技术寻找到了与RTEL1相互作用的蛋白HSP90,通过western blot对相互作用进行了验证,并发现该突变导致二者的相互作用减少.使用HSP90抑制剂STA-9090处理过表达RTEL1-WT以及RTEL1-MUT的293细胞系,发现HSP90的活性影响RTEL1的稳定性.因此,该患儿的RTEL1突变可能通过影响细胞增殖而导致先天性角化不良的发生,而RTEL1功能的改变可能源于突变影响了与HSP90的相互作用,从而影响了RTEL1的稳定性.

免疫抑制性受体LILRB2促进新型冠状病毒刺突蛋白介导的炎症过程

目的·探究免疫抑制性受体白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2,LILRB2)在新型冠状(新冠)病毒感染所导致的免疫细胞炎症因子释放中的作用及机制,为新冠病毒肺炎治疗提供潜在靶点。方法·收集包含刺突蛋白胞外段(S-ECD)的细胞上清液,分别使用Western blotting及流式细胞术检测上清液中蛋白表达情况及活性;通过流式细胞术及免疫共沉淀技术检测该上清液中S-ECD与LILRB2的结合;用刺突蛋白处理人单核细胞系THP1或人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),24 h后收集细胞,使用实时定量PCR技术检测相关炎症因子基因mRNA水平改变,同时使用酶联免疫吸附法检测细胞培养液中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及IL-1β含量;将si LILRB2通过Lipofectamine 3000试剂转染至人外周血CD33~+髓系细胞中,24 h后使用流式细胞术检测基因干扰效果;在对照组及LILRB2敲低的CD33~+髓系细胞中加入刺突蛋白培养24 h,使用酶联免疫吸附试剂盒检测细胞培养液中IL-6的含量变化。结果·实验成功构建可分泌具有生物活性的新冠病毒S-ECD的293T细胞转染体系;免疫共沉淀实验显示刺突蛋白与LILRB2蛋白存在相互作用,且流式细胞术结果提示刺突蛋白胞外段能够与细胞表面的LILRB2结合;与对照组相比,经刺突蛋白处理24 h的THP1细胞中IL-6、IL-8、精氨酸酶(arginase 1)及IL-2基因表达水平均有明显上调(均P<0.05);PBMC经刺突蛋白处理24 h后,IL-6、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-8、IL-10及IL-1β的mRNA水平均显著上升(均P<0.05);酶联免疫吸附实验结果显示,在PBMC培养液中加入刺突蛋白能够提高上清液中IL-6及IL-1β的浓度(均P<0.05);使用S-ECD或刺突蛋白处理CD33~+髓系细胞,IL-1β及IL-6含量随之升高(均P<0.05);并且过表达LILRB2的THP1细胞经刺突蛋白刺激后展现了更强的IL-6分泌能力(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,2条siRNA均能敲低CD33~+髓系细胞中的LILRB2,且si LILRB2-1敲除效果更好;LILRB2缺失后,刺突蛋白则不能促进CD33~+髓系细胞的IL-6分泌。结论·新冠病毒刺突蛋白通过与细胞表面分子LILRB2结合,引起髓系细胞释放IL-6、IL-1β等炎症因子,导致患者出现细胞因子释放综合征。