Notch信号转导通路在原代肝星状细胞体外培养活化中的作用

目的探讨Notch信号转导通路在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)体外培养活化中的作用。方法采用两步酶灌注法分离培养原代大鼠HSC并进行体外培养。激光共聚焦显微镜检测体外培养HSC第1天和第7天时形态、胞内维生素A、静止标志胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和活化标志α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化。采用RTPCR和Western blot检测HSC体外培养0天、3天和7天时上皮-间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)相关分子α-SMA、Ⅰ型胶原(collegenⅠ)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、蜗牛家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail 1)等和Notch信号转导通路(受体Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4与靶基因Hes1、Hey1、Hey2、HeyL)的变化。使用Notch受体阻断剂DAPT干预后,检测体外培养的HSC中活化相关分子(α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snail 1等)的改变。结果 (1)初分离的HSC经7天体外培养后逐渐向肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFs)样转化,表现为形态变长、维生素A水平和GFAP表达降低,α-SMA表达升高。(2)RT-PCR与Western blot结果表明,HSC体外培养存在自发EMT现象,表现为α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snai l表达上调及E-cadherin、CK7、CK19和Desmoplakin表达下调,同时Notch 2、Notch 3及Notch靶基因Hey2、HeyL表达逐渐增加。(3)使用DAPT后,可显著抑制原代HSC体外活化,表现为α-SMA、CollegenⅠ、N-cadherin和Snail 1的下调及E-cadherin、CK 7、CK 19和Desmoplakin转录或蛋白表达水平上调。结论 Notch信号转导通路的激活可能参与HSC的活化,可能是抗肝纤维化治疗的潜在靶点。

大鼠肝脏细胞同步分离与培养方法的建立

目的建立一种同时分离大鼠肝细胞(parenchyma cell,PC)、肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,SEC)与库普弗细胞(Kupffer cell,KC)的操作方案。方法采用EDTA/胶原酶两步灌注法获取肝细胞悬液,通过低速离心首先分离出PC组分,然后通过链蛋白酶E去除非实质细胞(nonparenchymal cell,NPC)中的PC,最后通Nycodenz和Percoll溶液进行梯度离心分离并纯化HSC、SEC和KC,体外培养并观察各细胞表型和功能的变化。结果 PC、HSC、SEC和KC平均每克组织产量分别为(26±9.2)×10~6、(1.5±0.2)×10~6、(7.4±1.5)×10~6和(3.1±0.9)×10~6,活力分别为(93.1±2.3)%、(90.1±3.4)%、(96.2±2.1)%和(98.2±1.7)%,纯度分别为(98.5±1.2)%、(95.1±2.5)%、(93.6±3.6)%和(98.1±1.4)%;HSC在体外培养过程中逐渐丧失维生素A,转化为肌成纤维样(myofibroblast,MF)细胞;SEC在体外培养第3天出现凋亡,至7天凋亡达到顶峰,随后少量存活的细胞在体外增殖,至培养14天时形成典型的"铺路石"形态;培养14天的SEC保留清道夫功能,但丧失窗孔结构;KC可在体外增殖,培养至14天仍具有吞噬功能,表达特征性标志CD68。结论本方法可同时分离大鼠肝脏细胞,细胞数量、纯度和活力可满足下游实验。

靶向重组信号结合蛋白-Jκ干扰腺病毒对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化影响的体内研究

目的通过体内实验探讨重组信号结合蛋白-Jκ(recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region,RBPJκ)在四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化发生发展中的作用。方法选取雄性SD大鼠40只为研究对象,以40%CCl4腹腔注射法制备SD大鼠肝纤维化模型。将大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、腺病毒空载体组(治疗对照组)和RBPJκ干扰腺病毒(Adsh RBPJκ)干预组(治疗组),每组各10只。采用苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色和天狼猩红染色观察细胞外基质(extracellular matrix,ECM)含量;采用碱水解法测定大鼠肝组织羟脯氨酸含量;采用q PCR、Western blot和免疫组织化学法检测大鼠肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1、RBPJκ及其靶基因Hey2、Hey L和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指标[蜗牛家族转录抑制因子1(snail family transcriptional repressor 1,Snail 1)、波形蛋白和E-钙连接素]的表达。结果 (1)与正常对照组相比,HE染色、Masson染色和天狼猩红染色示模型组大鼠肝细胞明显肿胀、变性,肝小叶结构被破坏,纤维组织增生明显;模型组大鼠肝内羟脯氨酸含量显著高于正常对照组[(99.35±8.12)μg/mg vs(285.12±12.32)μg/mg,t=38.193,P<0.001)]。(2)RTPCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,模型组大鼠RBPJκ靶基因Hey2、Hey L、胶原相关基因(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)以及EMT相关基因Snail 1和波形蛋白转录及翻译水平的表达均显著增加(P均<0.05),但E-钙连接素表达水平降低(P<0.05)。(3)与治疗对照组相比,Adsh RBPJκ(治疗组)可改善大鼠肝纤维化程度,降低羟脯氨酸含量[(193.52±13.12)μg/mg vs(279.85±8.32)μg/mg,t=15.92,P<0.001)]。(4)RT-PCR、Western blot及免疫组织化学结果显示,与治疗对照组相比,抑制肝RBPJκ表达(治疗组)不仅可降低RBPJκ及其靶基因Hey2、Hey L的表达水平,也可降低纤维化指标(α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1)及EMT相关基因(Snail 1、波形蛋白)的表达水平,同时还可上调E-钙连接素的表达(P<0.05)。结论高表达的RBPJκ可能参与了肝纤维化的形成过程,抑制RBPJκ可能为肝纤维化的防治提供新方向。

加权基因共表达网络分析微RNA-92b-3p在食管鳞状细胞癌中的作用及机制

目的通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)对食管鳞状细胞癌(ESCC)发展相关基因进行筛选,并通过实验验证。方法以基因芯片平台(GPL)570、GPL571、GPL96/97或GPL14613为基础,从基因表达数据库(GEO)中下载ESCC基因表达谱数据集;将所得差异基因结合癌症基因组图谱(TCGA)的81例ESCC患者的基因表达谱数据和临床信息,通过WGCNA方法构建由mRNA和miRNA组成的共表达模块。实时荧光定量PCR检测ESCC癌组织和癌旁组织中miRNA表达,免疫组织化学法检测Kruppel样因子4(KLF4)和细胞桥粒胶蛋白2(DSC2)的表达;转染ESCC细胞系ECA-109 miRNA模拟物后,流式细胞术检测细胞周期,Transwell小室和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力,激光共聚焦显微镜和蛋白质印迹法检测KLF4和DSC2的表达,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因。统计学分析采用t检验、秩和检验、卡方检验和Pearson相关分析。结果共筛选出4 023个差异蛋白编码基因(DEG)和328个差异表达微RNA(DEM);通过WGCNA共构建出11个基因模块。其中brown模块与肿瘤分级和T分期均呈负相关(r=-0.340、-0.268,P=0.002、0.016),has-mir-92b及其潜在靶基因KLF4和DSC2同时包含于brown模块。实时荧光定量PCR显示,ESCC组织中miRNA-92b-3p(has-miR-92b成熟体)表达水平高于癌旁组织[3.052(1.652, 5.371)比0.985(0.558, 2.032)],差异有统计学意义(Z=-4.021,P<0.01)。免疫组织化学显示KLF4和DSC2在ESCC组织中的阳性率分别为43.3%(13/30)和20.0%(6/30),分别低于对应癌旁组织的70.0%(21/30)和63.3%(19/30),差异均有统计学意义(χ^2=4.344、11.589,P均<0.05)。转染miRNA-92b-3p模拟物后,ECA-109细胞G0/G1期缩短[(63.71±2.83)%比(54.62±4.00)%],S期和G2/M期均延长[分别为(31.81±2.88)%比(41.20±2.87)%,(3.87±1.75)%比(8.10±1.71)%],差异均有统计学意义(t=3.215、4.000、2.998,P=0.032、0.016、0.040)。细胞侵袭和迁移能力显著增强[分别为79.67±27.54比280.33±46.18,(69.72±3.91)%比(84.90±5.25)%],差异均有统计学意义(t=6.465、4.019,P=0.003、0.016)。蛋白质印迹法检测结果显示,与转染对照模拟物组比较,转染miRNA-92b-3p模拟物组DSC2和KLF4表达水平均下降(分别为1.00±0.23比0.42±0.03,1.00±0.20比0.55±0.21),差异均有统计学意义(t=4.470、5.493,P=0.042、0.032)。双荧光素报告酶系统证实miRNA-92b-3p可以直接结合DSC2和KLF4。结论WGCNA是一种有效的系统生物学方法,通过此方法可识别出新的促癌基因miRNA-92b-3p。

整合转录组学识别食管鳞癌关键基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3

目的运用整合转录组学方法筛选参与食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展的相关基因,并观察其临床意义。方法从GEO数据库中下载ESCC表达谱的原始文件,使用R软件中的affy包读取数据并归一化,Robustrankaggreg包对各表达谱整合,以|Log2(倍数变化)|≥1.5和矫正P<0.05为标准获得差异表达基因(DEGs);利用STRING数据库构建蛋白质互作网络(PPI),cytoscape软件及MCODE插件进行网络可视化及模块挖掘,获取模块内的关键基因;采用癌症基因组图谱(TCGA)验证关键基因在ESCC组织及癌旁组织中的表达,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析关键基因对ESCC的诊断价值;免疫组化检测我院184例ESCC患者癌组织标本及50例癌旁组织中关键基因的蛋白表达,分析蛋白表达与临床特征的关系。结果通过整合数据集GSE77861、GSE100942、GSE26886、GSE17351、GSE38129、GSE33426、GSE20347、GSE23400,最终获得DEGs 244个,其中上调93个、下调151个;构建PPI网络后,模块挖掘显示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子3(CDKN3)被识别为模块内关键基因;TCGA验证结果显示,与癌旁组织比较,CDKN3 mRNA在ESCC组织中表达上调[3.291(IQR:2.833~3.659)vs 1.184(IQR:0.734~1.72),U=18.00,P<0.05];ROC曲线显示,曲线下面积为0.980,CDKN3 mRNA诊断ESCC的特异性为90.91%,敏感性为92.59%;免疫组化显示,ESCC组织中CDKN3的阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、T及M分期的ESCC患者CDKN3蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同N分期及临床分期的ESCC患者CDKN3蛋白表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CDKN3在ESCC组织及癌旁组织中表达存在差异,其可能是ESCC的关键基因;另外,CDKN3的表达与患者N分期及临床分期有关,其可作为诊断ESCC的生物标志物。