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CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用 被引量:1
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作者 徐宁 周甜 +2 位作者 侯国俊 沈南 唐元家 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期8-15,共8页
目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1978421为例,利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeat... 目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1978421为例,利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9]系统建立非编码区疾病相关的遗传突变位点功能的研究策略。方法·针对SNP rs1978421位点设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA),利用T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验在HEK293T细胞中验证sgRNA对靶点的切割效率。以电穿孔转染的方式将融合Cas9-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和sgRNA的表达质粒及同源重组的模板转染至U-937细胞内,通过流式分选得到单个的GFP阳性U-937细胞,培养14 d后进行基因型鉴定。筛选得到同源重组的细胞克隆后,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)对rs1978421上下游2 Mbp范围内的基因及miR-146a进行定量,分析rs1978421不同等位基因对miR-146a及其周围基因的表达影响。结果·T7EⅠ实验表明,约有24%的HEK293T细胞中的rs1978421位点发生切割。在U-937细胞内进行的同源重组实验中,共计得到141个细胞株;其中6个同源重组成功,成功率为4.3%。qPCR结果显示,在野生型TT与同源重组成功CC的U-937细胞中,miR-146a及所检测基因的表达情况均无显著变化(均P>0.05)。结论·SNP rs1978421对其周围2 Mb范围内的基因及miR-146a并无调控作用,但该研究证明了CRISPR介导的同源重组技术用于非编码区SNP位点功能研究的可行性。 展开更多
关键词 规律成簇间隔短回文重复序列 同源重组 全基因组关联研究 单核苷酸多态性
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构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究 被引量:1
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作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期297-301,共5页
目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-... 目的·结合Dox诱导型单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox^(+))和不添加Dox组(Dox^(-))。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ(T7 endonucleaseⅠ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox^(-)组、NCDox^(+)组和F4/80 Dox^(-)组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox^(+)组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox^(-)组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox^(+)组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。 展开更多
关键词 诱导型CRISPR/Cas9系统 Dox诱导型sgRNA表达载体 造血干细胞 基因编辑 巨噬细胞
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构建反转录病毒小向导RNA表达载体用于小鼠T细胞基因功能研究 被引量:1
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作者 赵艳娜 邱荣 +1 位作者 沈南 唐元家 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1585-1590,共6页
目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后... 目的·构建反转录病毒小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达载体,用于小鼠T细胞分化调控及其基因功能的研究。方法·表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的反转录病毒载体(MSCV-LTR-miR30-PIG,LMP)经过Xho1和Sal1双酶切后,回收得到反转录病毒载体骨架。以慢病毒sgRNA表达载体为模版,通过PCR扩增获得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段。利用同源重组将U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP片段组装进反转录病毒载体骨架。为了验证系统的有效性,设计靶向Il17a、Rorc和Irf4的sgRNA序列并进行克隆。分离Cas9转基因小鼠CD4 T细胞分别进行sgRNA反转录病毒感染,诱导其向Th17细胞分化。细胞因子染色,流式检测Il17a阳性细胞比例。2组独立样本数据比较采用非配对t检验。结果·①成功构建反转录病毒sgRNA载体。②利用反转录病毒载体向小鼠CD4 T细胞递送sgRNA并实现Il17a基因敲除。③Rorc-sgRNA和Irf4-sgRNA阳性群体中,Il17a阳性群体比率显著降低(P<0.05)。结论·利用sgRNA反转录病毒载体成功向目的细胞递送sgRNA并实现基因敲除。Rorc和Irf4基因敲除结果提示该系统可用于小鼠T细胞基因功能研究。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 Cas9转基因小鼠 反转录病毒载体 TH17细胞分化
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DNA甲基化与系统性红斑狼疮 被引量:7
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作者 袁敏 沈南 +1 位作者 唐元家 罗晓兵 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期2217-2220,2224,共5页
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an archetypical systemic,autoimmune inflammatory disease,of which the mechanism still not unveiled. Studies on epigenetics in SLE have long been the subject of investigation and a... Systemic lupus erythematosus (SLE) is an archetypical systemic,autoimmune inflammatory disease,of which the mechanism still not unveiled. Studies on epigenetics in SLE have long been the subject of investigation and as part of epigenetics. DNA methylation has been confirmed to play a role in the pathogenesis of SLE. The high autoreactivity of CD4+T cell from SLE patients is associated with DNA hypomethylation. DNA hypomethylation is crucial to induce SLE-like autoimmune disease in SLE-non-susceptible mice. The reactivation of inactive X chromosome by hypomethylation may lead to high incidence of SLE in women. Drug-induced SLE is also connected with DNA hypomethylation. To understand the role of DNA methylation in the onset of SLE comprehensively,we review the findings reported in the literatures about DNA methylation and SLE. 展开更多
关键词 红斑狼疮 系统性 DNA甲基化 CPG岛 X染色体
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长链非编码RNA AC073046.25在系统性红斑狼疮易感基因TET3表达调节中的作用
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作者 徐宁 周甜 +2 位作者 侯国俊 沈南 唐元家 《上海交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1030-1035,共6页
目的·探究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)AC073046.25在单核细胞中对Tet 甲基胞嘧啶双加氧酶3(Tet methylcytosine dioxygenase 3,TET3)表达的调控作用,分析其作为系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)诊... 目的·探究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)AC073046.25在单核细胞中对Tet 甲基胞嘧啶双加氧酶3(Tet methylcytosine dioxygenase 3,TET3)表达的调控作用,分析其作为系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)诊断的生物标志物的可行性。方法·通过表观遗传学修饰及胞浆胞核定位对AC073046.25的细胞特异性及功能进行预测。在U-937细胞中利用反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)对AC073046.25进行敲低(knock down),通过实时荧光定量PCR分析ASO敲低AC073046.25后对TET3表达水平的影响。收集健康志愿者(n=32)与SLE患者(n=46)的单核细胞,通过皮尔逊系数分析AC073046.25与TET3表达水平之间的相关性。将健康志愿者记为健康对照组,同时按系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评分标准将SLE患者分为疾病稳定组和疾病活跃组,采用非配对双侧student's t检验比较AC073046.25与TET3在健康对照组及不同疾病活动组间的差异。结果·表观遗传学数据及胞浆胞核定位实验提示,AC073046.25可能在单核细胞中参与TET3的表达调控。在U-937细胞中,ASO敲低AC073046.25后,TET3表达水平降低(ASO组均P=0.002)。相关性分析显示,原代单核细胞中AC073046.25与TET3的表达呈正相关(r=0.650,P=0.000)。非配对双侧student's t检验结果显示,分别与健康对照组和疾病稳定组相比,AC073046.25在疾病活跃组中的表达水平降低(P=0.002,P=0.000)。结论·在单核细胞中AC073046.25能够调控TET3的表达,在疾病活动度较高的SLE患者单核细胞中其表达水平显著降低;继而提示,AC073046.25可作为活跃性SLE的生物标志物辅助疾病活动性诊断。 展开更多
关键词 长链非编码RNA Tet甲基胞嘧啶双加氧酶3 系统性红斑狼疮 易感基因
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PBX1基因对系统性红斑狼疮易感基因IFI16表达的影响 被引量:5
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作者 徐宗怡 黄新芳 +5 位作者 唐元家 倪旭鸣 黄秀琴 钱其军 吴慧 沈南 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期306-309,共4页
探讨PBX1基因转染人单核细胞系THP1后,对IFI16基因表达的影响。以携带人PBX1基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(pDC315-PBX1-EGFP)转染THP1细胞后,采用实时定量PCR(RT-PCR)和Western blot技术分别在mRNA水平和蛋白水平检测PBX1和IF... 探讨PBX1基因转染人单核细胞系THP1后,对IFI16基因表达的影响。以携带人PBX1基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(pDC315-PBX1-EGFP)转染THP1细胞后,采用实时定量PCR(RT-PCR)和Western blot技术分别在mRNA水平和蛋白水平检测PBX1和IFI16表达的变化。结果,pDC315-PBX1-EGFP转染THP1细胞后,PBX1基因的表达水平都增高,同时发现IFI16基因的表达水平降低。PBX1作为一种转录因子,能调节干扰素诱导蛋白IFI16的表达。 展开更多
关键词 PBX1基因 IFI16基因 人单核细胞系THP1细胞 表达
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DNA甲基化转移酶在MRL/lpr狼疮鼠CD4^+T淋巴细胞中的表达水平研究及功能分析 被引量:4
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作者 袁敏 慕丽娟 +5 位作者 崔慧娟 罗晓兵 黄新芳 郑一君 唐元家 沈南 《中华风湿病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期521-524,共4页
目的研究DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在发病MRL/lpr狼疮鼠脾脏CD4^+T淋巴细胞的表达情况,并对其与免疫相关的甲基化敏感基因ITGAL、CD70的表达水平进行相关性分析。方法CD4单抗标记的免疫磁珠分选小鼠脾脏CD4^+T淋巴细胞... 目的研究DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在发病MRL/lpr狼疮鼠脾脏CD4^+T淋巴细胞的表达情况,并对其与免疫相关的甲基化敏感基因ITGAL、CD70的表达水平进行相关性分析。方法CD4单抗标记的免疫磁珠分选小鼠脾脏CD4^+T淋巴细胞,实时定量聚合酶链反应(real—time PCR)测定DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和免疫相关的甲基化敏感基因ITGAL、CD70的相对表达量。结果①DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在发病MRL/lpr狼疮鼠CD4^+T淋巴细胞中与健康对照BALB/c小鼠相比,表达水平均有降低趋势,其中DNMT3B差异有统计学意义(P〈0.05);CD70在发病MRL/lpr狼疮鼠表达水平升高(P〈0.01),ITGAL表达水平呈升高趋势,差异无统计学意义(P〉0.05)。②相关性分析显示:DNMT3B与CD70分子表达水平呈显著负相关(r=-0.769,P〈0.01)。结论DNMT3B在发病MRL/lpr狼疮鼠CD4^+T淋巴细胞中表达水平降低,可能通过影响免疫相关的甲基化敏感基因CD70的表达,造成CD4^+T淋巴细胞功能异常,参与系统性红斑狼疮的发病。 展开更多
关键词 红斑狼疮 系统性 DNA甲基化 小鼠 近交MRL LPR CD4阳性T淋巴细胞
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B细胞分化成熟的microRNA研究进展 被引量:3
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作者 袁敏 沈南 唐元家 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期157-160,共4页
microRNA,新近发现的一类重要的转录后水平的调控分子,是一种长度介于18~25 bp之间的单链RNA分子,其一般通过与靶序列3′UTR区配对碱基的相互作用,影响mRNA的稳定性或者翻译效率从而起到对靶基因功能的调控作用。该小分子作为生命过程... microRNA,新近发现的一类重要的转录后水平的调控分子,是一种长度介于18~25 bp之间的单链RNA分子,其一般通过与靶序列3′UTR区配对碱基的相互作用,影响mRNA的稳定性或者翻译效率从而起到对靶基因功能的调控作用。该小分子作为生命过程中一类重要调节分子参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等基本的生理过程,对于细胞的信号转导、组织器官的分化发育也有一定的调节作用。在人类疾病(白血病、肿瘤、精神病及自身免疫性疾病等)中发现了特征性的异常microRNA表达,进一步说明该分子在生理病理状态下的重要作用。最近的许多研究表明一系列的microRNA参与免疫反应的调控,包括T/B细胞的发育分化、抗体类型的转换、单核/中性粒细胞的增殖、炎症因子的释放等过程。本文主要阐述近年来microRNA在免疫学方面B淋巴细胞分化发育中的作用。 展开更多
关键词 MICRORNA B细胞 免疫
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