新生儿遗传病基因筛查技术及相关疾病

新生儿遗传病筛查目前以代谢物生化指标检测为主,检测结果假阳性率较高,且有一定的假阴性,筛查的病种较少。近几年逐步开展的新生儿遗传病筛查基因检测技术包括定量聚合酶链反应技术和高通量测序。高通量测序又分为基因包测序、全外显子组测序和全基因组测序。但目前用于新生儿遗传病筛查的基因技术主要为定量聚合酶链反应技术和基因包测序。新生儿基因筛查病种由单病种筛查如耳聋、脊髓性肌萎缩及重症联合免疫缺陷病等向多病种筛查发展。新生儿基因筛查结果解读除遵循美国医学遗传学与基因组学学会联合分子病理协会在2015年提出的“序列变异解读标准和指南”外,还需要结合生化指标检测及其他检测结果综合分析。新生儿遗传病基因筛查的开展需要遵循伦理原则,包括将新生儿基因筛查作为公共卫生项目的伦理、新生儿及其家庭成员知情选择权和隐私权伦理等。新生儿遗传病基因筛查的开展将使更多的遗传病患者能够早期诊断,改善其预后,在新生儿遗传病筛查领域具有里程碑意义。

3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床特点及基因变异分析

目的了解3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的临床特点及基因变异情况。方法分析6例3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症患儿的临床资料及基因检测结果。结果6例患儿,男性3例,女性3例。1例家族史阳性。3例患儿当地医院行新生儿筛查提示该疾病,2例患儿为发病后临床诊断,1例患儿至今未发病。5例患儿发病年龄10天~5岁。初诊年龄为1个月~7岁,发病时均有不同程度的代谢危象、低血糖和高乳酸血症等表现。2例患儿死亡。血串联质谱显示3-羟基异戊酰肉碱升高,部分患儿伴有己二酰肉碱升高;尿有机酸分析提示3-羟基-3-甲基戊二酸显著升高,伴3-甲基戊烯二酸、3-羟基异戊酸等增高。4例患儿基因检测均发现HMGCL基因变异:2例c.122G>A(p.R41Q)纯合;1例c.697C>T(p.H233Y)纯合;1例c.145-2A>G和c.590G>A(p.C197Y)复合杂合。其中,c.697C>T(p.H 233Y)、c.145-2A>G和c.590G>A(p.C 197Y)变异均为首次报道,蛋白结构预测均为可能有害,ACMG评级为可能致病。另2例患儿未行基因检测。结论3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症临床表型多样,结合血串联质谱、尿有机酸分析及基因诊断可确诊。对3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A裂解酶缺乏症的筛查有助于早期确诊及合理治疗。

有机酸血症的诊治及筛查

有机酸血症(organic acidemia)是由于体内有机酸代谢过程中酶的功能缺陷,导致体内有机酸及其旁路代谢产物蓄积,从而引起的一类疾病。1966年Tanaka运用气相色谱/质谱联用技术(gas chromatographic/mass spectrometry,GC/MS)发现了首例异戊酸血症,迄今已陆续发现了数十种疾病。这些疾病的临床表现无特异性,自胎儿期到成年各个时期均可发病。

720例甲基丙二酸血症MMACHC基因c.609G>A突变患者临床特征及随访分析

目的:分析携带MMACHC基因c.609G>A(p.W203X)突变的cblC型甲基丙二酸血症(MMA)患者的临床表现、治疗效果、预后及影响因素。方法:回顾性分析2007至2020年在上海交通大学医学院附属新华医院就诊的720例携带c.609G>A突变的cblC型MMA患者的临床及实验室检查资料。根据基因突变位点不同将患者分为三组,携带c.609G>A纯合突变的患者为A组(172例);携带c.609G>A与c.482G>A(p.R161Q)、c.80A>G(p.Q27R)及c.394C>T(p.R132X)中任一突变形成的复合杂合突变患者为B组(169例);携带c.609G>A与上述突变位点以外突变[如c.658_660delAAG(p.K220del)、c.315A>T(p.Y105X)、c.567dupT(p.I190fs*13)]的复合杂合突变患者为C组(379例)。对不同基因突变位点患者的临床表现,血酰基肉碱、血同型半胱氨酸、尿有机酸水平以及治疗效果进行比较,根据随访结果采用logistic回归分析患者预后的影响因素。结果:720例患者中306例(42.5%)来自新生儿筛查,其中156例发病;414例未进行新生儿筛查的患者中10例因同胞确诊后诊断(临床未发病),其余404例均为临床发病病例。560例发病患者中,发病年龄中位数为1.2个月(3 d~20岁)。B组发病年龄晚于A组和C组,三组间发病年龄差异有统计学意义(P<0.01)。患者临床症状各异,1岁以内发病患者多表现为呕吐、腹泻、喂养困难及抽搐,1岁以后发病患者多以运动障碍及智力落后为主要表现。肾脏疾病起病的患者均携带c.80A>G或c.482G>A突变,伴有肺动脉高压的患者均携带c.80A>G突变。长期随访患者621例,其中预后正常156例(25.1%),落后433例(69.7%),死亡32例(5.2%)。剔除失访、死亡及资料缺失的患者,对559例患者的预后影响因素进行logistic回归分析,结果显示新生儿筛查与否、发病与否、发病年龄及基因突变位点对预后的影响有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:MMACHC基因c.609G>A突变与早发型MMA相关,患者多于出生后1个月内起病。维生素B12肌内注射对携带不同突变的患者均有效。新生儿筛查对患者预后有益,而临床发病则不利于患者预后,携带c.609G>A纯合突变患者较携带c.609G>A与其他突变位点形成的复合杂合突变患者预后差。

干血滤纸片类固醇激素质控品制备及评价

目的探讨用于类固醇激素液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测,室内质控干血滤纸片(DBS)类固醇激素质控品的制备方法。方法收集全血,分离血细胞和血浆,生理盐水洗涤血细胞,活性炭过夜吸附血浆,添加标准品,制成低、中、高三个浓度的DBS类固醇激素质控品,LC-MS/MS检测并分析其精确度、准确度、稳定性及不同血斑间的差异。结果 DBS类固醇激素质控品批内精确度和准确度分别为2.4%~7.0%,102.0%~111.0%;批间精确度和准确度分别为5.1%~9.8%,99.0%~114.8%;-20℃保存5个月,月间差异无统计学意义(P>0.05);不同血斑间变异系数为3.3%~8.2%,变异系数较小。结论配制的DBS类固醇激素质控品具有良好的精确度、准确度及稳定性,血斑间差异小,符合室内质控品要求,可用于LC-MS/MS检测类固醇激素的室内质控。

五例cblX型甲基丙二酸血症患儿的临床特征及基因型分析

目的:探讨钴胺素(cbl)X型甲基丙二酸血症(MMA)患儿的临床表型及基因型特点。方法:收集2016至2020年在上海交通大学医学院附属新华医院和上海市儿童医院就诊的5例cblX型MMA患儿的临床资料。采用串联质谱法检测血酰基肉碱水平,气相色谱-质谱法检测尿有机酸,全外显子基因测序法检测致病基因,并利用生物信息学分析方法预测新突变对三维蛋白质结构的影响。结果:5例cblX型MMA确诊患儿,男性4例,女性1例,发病年龄为出生后0~6个月。4例男性患儿的主要临床表现为顽固性癫痫、智力运动发育落后,代谢异常均表现为轻度血同型半胱氨酸水平增高,其中伴尿甲基丙二酸轻度升高3例,伴血丙酰基肉碱(C3)、C3/乙酰基肉碱(C2)升高1例;基因检测发现2例携带宿主细胞因子C1(HCFC1)已知基因突变c.344C>T(p.A115V),另外2例携带新的致病基因突变,分别为c.92G>A(p.R31Q)和c.166G>C(p.V56L)。这三种基因突变均位于HCFC1蛋白的Kelch结构域中。1例女性患儿携带c.3731G>T(p.R1244L)突变,临床症状较轻,仅尿甲基丙二酸轻度升高。结论:cblX型MMA患儿的临床表现多为顽固性癫痫、智力运动发育落后等严重的神经症状,代谢异常表现为血同型半胱氨酸伴甲基丙二酸(尿甲基丙二酸或/和血C3、C3/C2)升高,临床和生化表型呈分离现象,需要结合基因检测结果诊断。

质谱技术联合基因分析进行戊二酸血症Ⅰ型产前诊断研究

目的探讨质谱技术羊水代谢物检测联合基因分析对戊二酸血症Ⅰ型（GA－Ⅰ）的产前诊断价值。方法2009年1月至2016年12月，上海交通大学医学院附属新华医院小儿内分泌/遗传科对生育过GA－Ⅰ患儿（先证者）的孕妇24例进行产前诊断，同期进行常规染色体检查的先证者不是有机酸血症的孕妇24例作为对照组。2组孕妇均于妊娠16～20周羊膜腔穿刺术抽取羊水。串联质谱检测羊水戊二酰肉碱（C5DC）和C5DC与辛酰肉碱（C8, C5DC/C8）比值，气相色谱质谱检测羊水戊二酸水平，羊水细胞进行GCDH基因检测。结果通过基因分析联合质谱检测结果确诊4例胎儿为患儿，其孕妇羊水C5DC[1.58（0.89～2.85） μmol/L]、C5DC/C8 [19.74（12.40～25.93）]、戊二酸[129.96 （90.09～266.02）mmol/mol肌酐]水平均显著超过参考值上限，其中1例的先证者基因只检测到1个变异，羊水细胞也仅检测到1个变异，依据羊水C5DC、C5DC/C8及戊二酸水平显著增高确诊。20例胎儿判断为非GA－Ⅰ患儿，其中2例的先证者基因只检测到1个变异，羊水细胞也仅检测到1个变异，C5DC、C5DC/C8及戊二酸水平正常，排除胎儿为患儿。2例羊水C5DC或戊二酸稍高于正常参考值上限，依据基因检测排除胎儿为患儿。结论质谱技术检测羊水C5DC、C5DC/C8及戊二酸水平联合GCDH基因分析对GA－Ⅰ进行产前诊断，可弥补因先证者基因变异不明确，不能进行产前诊断的不足，又可避免因质谱技术检测羊水代谢物结果轻度异常，不能判断胎儿是否为患儿的缺点，两者联合对GA－Ⅰ产前诊断结果更加可靠。

一例发育落后合并多发畸形的16p13．11微缺失综合征患儿的临床及遗传学分析

目的明确1例发育落后合并多发畸形的患儿的遗传学病因。方法应用常规G显带技术分析患儿及其父母的外周血染色体，之后应用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）微阵列芯片检测患儿的微小染色体改变，并用荧光定量PCR验证芯片的检测结果。结果患儿的临床表现包括发育落后、特殊面容以及多发畸形。常规染色体核型分析显示患儿及其父母的核型均正常，其中患儿核型为46，XY-SNP芯片检测发现患儿染色体16p13．11区存在846kb的微缺失。荧光定量PCR检测结果与芯片一致。结论确诊了1例16p13．11微缺失综合征，后者缘于16p13．11区的重复序列发生的非等位同源重组。SNP微阵列芯片结合荧光定量PCR技术有助于发现染色体微缺失，为明确发育落后患儿的诊断和遗传咨询提供重要的线索。

质谱技术在遗传代谢病及产前诊断中的应用

质谱技术在遗传代谢病检测方面的应用，主要是利用串联质谱技术检测干血滤纸片中小分子物质，如氨基酸、酰基肉碱、类固醇激素及溶酶体酶分解产物，进行氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢、类固醇激素代谢及溶酶体代谢病的筛查及诊断，利用气相色谱质谱技术检测尿有机酸进行有机酸血症的诊断，辅助氨基酸及脂肪酸氧化代谢病的诊断。目前，串联质谱技术已经成为新生儿氨基酸、有机酸及脂肪酸氧化代谢病筛查的主要方法，得到广泛应用，在肾上腺疾病及溶酶体疾病方面仅部分国家及地区开展新生儿筛查。质谱技术可以通过检测孕妇羊水中的酰基肉碱及有机酸对有机酸血症进行产前诊断。

液相色谱-串联质谱技术检测干血滤纸片类固醇激素谱方法建立研究

目的建立液相色谱-串联质谱技术(liquid chromatographytandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测干血滤纸片(dried blood spots,DBS)中类固醇激素谱的方法。方法取含不同浓度类固醇激素(包括雄烯二酮、睾酮、17-羟孕酮、孕酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇)的2个DBS(直径3 mm),用含已知类固醇激素内标的1∶1甲醇/乙腈萃取,孵育震荡后氮气吹干,复溶后LC-MS/MS检测。评价方法的线性、精确度、准确度。收集7例21-羟化酶缺乏症患儿及23例正常婴幼儿DBS样本,LC-MS/MS测定样本中类固醇激素浓度。结果 7种类固醇激素批内和批间精确度为3.3%~10.9%,准确度为100.4%~116.5%,最低检测限为0.03~0.25μg/L,最低定量限为0.125~1.000μg/L;不同浓度的类固醇激素实测浓度与加入浓度之间的相关系数为0.997~0.999。21-羟化酶缺乏症患儿DBS样本中雄烯二酮、17-羟孕酮、孕酮、21-脱氧皮质醇、皮质醇浓度均显著高于正常男性婴幼儿,具有统计学意义(P<0.05)。结论本研究建立了LC-MS/MS测定DBS中类固醇激素谱的方法,具有较好的精确度、准确度及浓度线性关系,可用于临床类固醇激素检测,有助于先天性肾上腺皮质增生症的临床诊断及治疗效果评价,并有望用于此病的新生儿筛查。

糖原累积病Ib型并发克罗恩病一例

患儿女，4岁，因“间断腹痛伴腹泻近1个月”人院。1个月前患儿间断出现腹痛、腹泻伴发热。腹痛多位于脐周，痛时多汗，持续数分钟，3～4次／d，伴水样腹泻2～3次／d，无黏液血便，无果酱样便。

丙酸血症患儿82例治疗及随访分析

目的了解丙酸血症患儿的治疗现状和预后。方法对2002年12月至2020年6月上海交通大学医学院附属新华医院小儿内分泌遗传代谢科诊治的82例丙酸血症患儿临床表现、实验室检测结果、治疗措施及随访情况进行总结和分析。采用t检验或Mann-Whitney U检验对数据进行统计学分析。结果(1)82例患儿中,男50例(61.0%),女32例(39.0%);59例(72.0%)为临床发病后确诊;22例(26.8%)为新生儿筛查确诊,其中8例未发病;1例(1.2%)为同胞确诊后完善相关检查确诊,但未发病。73例临床发病患儿初次发病年龄为4.5个月(2 d~5岁),其中28例(38.4%)为早发型(≤3月龄发病)。(2)共26例进行了MRI检查,其中19例(73.1%)存在异常影像学表现。(3)53.3%(16/30)患儿乳酸升高,水平为3.5(2.1~4.3)μmol/L;87.5%(35/40)患儿血氨升高,水平为105.4(34~907)μmol/L。(4)28例早发型患儿中,16例(57.1%)死亡,12例(42.9%)存活。存活与死亡患儿血丙酰肉碱水平、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值,以及尿3-羟基丙酸和甲基枸橼酸水平差异无统计学意义。(5)75例(91.5%)患儿检测到基因突变,其中34.7%(26/75)检测到PCCA基因突变,64%(48/75)检测到PCCB基因突变;1例(1.3%)在PCCA和PCCB各检测到1种已报道致病突变,所有突变均来源于父母。(6)随访至2020年6月,82例患儿中,57例(69.5%)患儿存活,25例(30.5%)死亡。死亡患儿均为严重酸中毒导致多器官功能衰竭,其中16例为早发型,9例为晚发型。结论丙酸血症患儿多在临床发病后确诊,治疗方法以饮食控制为主。经治疗,部分新生儿筛查确诊的患儿未发病,但部分发病后确诊的患儿仍有发病,可能出现发育落后。建议积极开展新生儿串联质谱筛查,以早期诊断和治疗。

极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症

极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCADD)是线粒体脂肪酸β氧化初始阶段的缺陷。其发病年龄可以从新生儿期到成年,症状包括低血糖、横纹肌溶解、骨骼肌无力和心肌病等,并可因长时间禁食或疾病诱发。早期诊断、治疗和监测可降低病死率。诊断评估方法最常见的是血浆酰基肉碱谱和ACADVL基因分子检测。如单独的分子测序不足以确定诊断或新发现具有未知临床相关性的突变时,功能测试包括白细胞、成纤维细胞酶分析是有用的辅助诊断。治疗包括避免长时间禁食,低长链脂肪高碳水化合物饮食,并辅以中链三酰甘油(MCT)。

甲基丙二酸尿症生化 基因诊断及产前诊断

甲基丙二酸尿症(MMA)是中国最常见的有机酸血症,其生化诊断指标为血丙酰肉碱、丙酰肉碱与乙酰肉碱比值、尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平增高,合并同型半胱氨酸血症(合并型MMA)血同型半胱氨酸水平增高。已知导致MMA的基因突变主要包括MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、LMRD1、HCFC1、MCEE、SUCLG1、SUCLG2及ABCD4,检测到致病变异具有诊断价值。MMA产前诊断主要通过孕妇羊水细胞或胎盘绒毛膜细胞基因突变检测。如果胎儿为MMA,母亲羊水丙酰肉碱与乙酰肉碱比值增高、甲基丙二酸及甲基枸橼酸增高,可以作为此病产前诊断的辅助方法。羊水总同型半胱氨酸检测可作为合并型MMA的产前诊断方法。

重视脂肪酸氧化代谢病的筛查与诊治

脂肪酸氧化代谢病(fatty acid oxidation disorders,FAOD)是脂肪酸氧化代谢过程中十余种疾病的总称,均属于常染色体隐性遗传病,是常见的遗传代谢病,从新生儿至成人均可发病,临床表现无特异性,主要表现为肝病、心肌病及肌肉疾病。串联质谱检测血游离肉碱、酰基肉碱水平及基因检测是诊断此类疾病的重要方法。串联质谱新生儿筛查有助于FAOD的早诊断及早治疗。原发性肉碱缺乏症及多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症有特异治疗药物,效果较好,其他疾病无特异药物,需要对症治疗。

努力提高先天性肾上腺皮质增生症的筛查质量和诊治水平

多年以来,我国儿科医师一直关注先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia,CAH）的临床诊治和预防,并积累了一定的诊治经验.我国自20世纪90年代开展新生儿CAH筛查,至今约有近百家的新生儿筛查实验室开展了CAH筛查,初步获得了患病率资料[1-2],通过积极治疗降低新生儿死亡率,减少了女婴外生殖器男性化而造成性别误判,改善生长发育,取得了较好的社会效益.

不同方法测定PKU随访患者干血滤纸片Phe浓度的比较

目的 比较串联质谱（MS/MS）,包括非衍生标准曲线定量法（简称＂标曲法＂）和衍生法、非衍生法及荧光法在苯丙酮尿症（PKU）随访患者血苯丙氨酸（Phe）浓度测定中的应用.方法 收集上海新华医院随访的204例PKU患者干血滤纸片（DBS）样本;MS/MS标曲法、衍生法、非衍生法及荧光法测定Phe浓度,分为低、中、高,即〈360、360-600和〉600 μmol/L 3组,对Phe检测值进行一致性检验及非参数检验.结果 MS/MS标曲法批内和批间精密度为4.0%-7.2%,回收率为93.2%-97.3%.一致性检验显示各组Phe检测值在95%一致性界限外的值不超过8.1%.低、中浓度组,荧光法、MS/MS标曲法和衍生法Phe检测值四分位数分别为176（118,251）μmol/L、174（94, 273）μmol/L、153（94,242）μmol/L,和540（478,578）μmol/L、485（414,529）μmol/L、466（402,513） μmol/L;荧光法较MS/MS标曲法高4.8%-9.0%,（Z=-3.787--2.674,P〈0.01）;MS/MS非衍生法较标曲法低3.9%-5.2%,（Z=-7.474--5.747,P〈0.01）;高浓度组,MS/MS标曲法、衍生法、非衍生法和荧光法检测值为807（695,924）μmol/L,700（575,785）μmol/L,680（623,771）μmol/L和711（674,794）μmol/L,MS/MS标曲法较其他方法高10.9%-16.2%,（Z=-4.458--4.356,P〈0.01）.结论 MS/MS标曲法测定DBS中Phe浓度特异性和准确度较好,4种方法测定血Phe浓度一致性较好,虽检测值存在差异,但均可用于多数PKU患者的Phe浓度监测.