内脏异位综合征的临床特征及死亡危险因素分析

目的·分析内脏异位综合征患者死亡的危险因素。方法·收集56例明确诊断为内脏异位综合征患者的临床资料，分析其临床特征和死亡危险因素。结果·解剖分类：右侧异构47例，左侧异构9例，右侧异构比左侧异构合并较严重的心血管畸形。56例患者中死亡6例（10.7%），均为右侧异构，其中5例（83.3%）合并中重度房室瓣反流；Mann-Whitney秩和检验和χ2分析结果显示：死亡组与生存组患者中重度房室瓣反流和术后低血氧饱和度（≤80%）发生率的差异有统计学意义（P=0.0336，P=0.0417）；二分类Logistic回归分析显示，中重度房室瓣反流是内脏异位综合征患者死亡的危险因素[OR（95%CI）为11.666（1.254～108.557），P=0.0309]。结论·中重度房室瓣反流是内脏异位综合征患者死亡的重要危险因素。

GAL4/VP16融合人工转录因子的活性研究

目的构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体和含有上游激活序列(UAS)启动子驱动报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体组成的GAL4/VP16-UAS系统,观察融合转录因子GAL4/VP16的活性。方法构建含有融合转录因子GAL4/VP16的表达载体pcDNA3-GAL4/VP16,含有5个拷贝UAS串联排列序列和腺病毒E1b基因核心启动子的人工杂合启动子驱动报告基因EGFP的表达载体pGL3-G5E1b-TATA-EGFP,利用脂质体将两种载体瞬时转染Hep3B和HEK293细胞,48 h后采用RT-PCR和流式细胞术检测EGFP的表达,观察GAL4/VP16融合转录因子对G5E1B-TATA的转录调节作用。结果在GAL4/VP16融合转录因子存在的情况下,G5E1b-TATA启动子活性明显上调,甚至可以达到巨细胞病毒(CMV)启动子的活性程度。结论 GAL4/VP16融合转录因子具有上调G5E1B-TATA启动子转录活性的作用,并且该转录活性足以达到驱动下游目的基因高效表达的水平,在基因治疗和基因功能的研究中具有一定的应用潜力。

TBX1基因启动子活性的初步研究

目的研究心脏发育关键转录因子T-box家族成员TBX1基因启动子的活性并确定关键区域。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TBX1基因转录起始位点上游启动子不同长度片段,酶切连接至pGL3-Basic报告基因载体,构建含不同长度TBX1基因启动子调控荧光素酶的报告基因。利用FuGene HD转染试剂将不同长度的TBX1基因启动子调控荧光素酶的报告基因载体瞬时转染293T、COS7细胞,42 h后经荧光素酶检测,比较不同长度TBX1基因启动子的活性。结果不同长度TBX1基因启动子活性不同,其中5 kb和1.2 kb的TBX1基因启动子活性较高;TBX1基因启动子在不同细胞中表现的活性不同,COS7细胞中5 kb的基因启动子活性最高,297T细胞中1.2 kb的基因启动子活性最高。结论 TBX1启动子在转录水平上可以驱动报告基因表达,不同长度启动子的活性不同,推测转录起始位点上游1.2 kb区域是TBX1基因启动子关键区域。

完全性肺静脉异常连接患者手术后早期死亡危险因素分析

目的分析完全性肺静脉异常连接患者手术后早期死亡的危险因素。方法收集52例不合并内脏异位、单心室等复杂畸形的简单肺静脉异常连接患者的临床资料,分析患者术后早期死亡(术后30 d内死亡)的危险因素。结果 52例患者中,术后早期死亡5例(9.62%),其中4例体质量不足4 kg,1例体质量为4 kg;年龄均小于3个月,2例为新生儿;解剖分类:心上型2例,心内型1例,心下型2例。独立样本T检验和χ2检验分析结果显示:生存组与死亡组患者的体质量(P=0.005)、身长(P=0.021)、解剖分类(P=0.007)及术前左心房内径(P=0.016)的差异均有统计学意义;低体质量(≤4 kg)进入Logistic回归方程(OR=22.857,P=0.009)。结论低体质量(≤4 kg)是完全性肺静脉异常连接患者术后早期死亡的独立危险因素。

CITED2基因在内脏反位患者中的突变分析

目的·研究CITED2 基因突变与内脏反位的关系。方法·选取24 例内脏反位的患者和100 名健康儿童对照,从外周血提取基因组DNA,使用PCR 扩增技术和Sanger 测序技术来检测CITED2 的外显子区域;通过软件Sift、PolyPhen-2、PROVEAN 和MutationTaster 预测突变是否存在致病性;使用Y. Zhang 实验室服务器构建蛋白质的三维结构,导入SWISS-PdbViewer 查看突变对蛋白质结构的影响。结果·在1 例内脏反位的患者中发现了1 个新发的杂合错义突变c.418C>T(p.P140S),此突变在对照组中未发现。软件SIFT 和Mutation Taster 预测此突变具有致病性。SWISS-PdbViewer 显示,第140 位脯氨酸突变为丝氨酸后,第137 位天冬氨酸上的3个氢键全部断开,第140 位丝氨酸和第142 位丙氨酸重新建立了一个异常弱氢键。结论· CITED2 基因c.418C>T(p.P140S)突变可能影响CITED2 的生物学活性,与内脏反位的发生有关。

心脏圆锥动脉干畸形患儿TBX1C基因3'UTR区域突变分析

目的筛查心脏圆锥动脉干畸形(CTHD)患者中TBX1C基因3'UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法选取无22q11.2区微缺失的52例CTHD患儿(CTHD组)和89名健康儿童(对照组)作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3'UTR区序列,所有扩增片段均进行双向测序;将测序结果与GenBank中TBX1C 3'UTR序列(NM 080647.1)进行比对,筛查出可能存在的基因突变;PicTar和TargetScan在线预测软件预测可能与TBX1C基因3'UTR区结合的微RNA(miRNA),分析TBX1C基因3'UTR区突变对miRNA调控TBX1C基因表达的影响。结果在CTHD组中发现1例突变c.*164_*165insC,即在距离终止密码子164位与165位核苷酸之间插入1个胞嘧啶;该突变在对照组中不存在,其他研究中未见报道,为新发突变;预测结果显示10种miRNA能与TBX1C基因3'UTR区结合,该突变并不位于10种miRNA与TBX1C3'UTR的结合区域。结论 TBX1C基因3'UTR区域存在新发突变c.*164_*165insC,该突变可能改变TBX1C3'UTR区域与miRNA结合的空间构象,进而影响miRNA对TBX1C基因表达的调控作用。

靶向敲除JARID2基因对葡萄膜黑色素瘤细胞生长与转移的影响

目的探讨JARID2基因在葡萄膜黑色素瘤细胞生长和转移中的作用。方法采用real-time PCR检测葡萄膜黑色素瘤细胞系OM431和SP6.5中JARID2 mRNA的表达。利用shRNA敲除OM431和SP6.5的JARID2基因,构建稳定转染细胞系sh SP6.5和sh OM431,Western blotting检测JARID2蛋白表达变化,观察靶向敲除JARID2基因对葡萄膜黑色素瘤细胞生长、转移及体外克隆形成的影响。结果 OM431和SP6.5细胞中JARID2 mRNA呈过表达。Western blotting检测结果显示:与OM431和SP6.5细胞比较,sh OM431和sh SP6.5细胞中JARID2蛋白表达显著减少。靶向敲除JARID2基因的葡萄膜黑色素瘤细胞的生长受到抑制,细胞转移数量减少,体外克隆形成率降低。结论 JARID2基因在葡萄膜黑色素瘤细胞的生长、转移和克隆形成能力中起着重要的作用。

1例Alagille综合征患儿JAG1基因筛查及突变功能分析

目的·对1例Alagille综合征患儿进行JAG1基因筛查及突变功能分析。方法·收集患儿及其父母的临床资料及辅助检查结果,抽提DNA进行JAG1基因突变筛查。构建JAG1野生型及突变型表达质粒,转染NIH-3T3细胞,通过real-time RT-PCR、Western blotting分析突变体mRNA和蛋白的表达量;糖苷内切酶H消化实验分析蛋白糖基化结构;RBP-Jκ荧光素酶报告基因检测突变体蛋白对Notch信号通路转录因子RBP-Jκ的激活作用。结果·在患儿及其父亲中发现1个未报道过的JAG1错义突变c.1655C>T(p.Pro552Leu),该突变在患儿母亲及对照健康儿童中未发现。与野生型相比,突变型JAG1在mRNA、蛋白表达量上无明显改变,翻译后糖苷化修饰正常,但突变蛋白对Notch信号通路转录因子RBP-Jκ的激活作用减弱。结论·该患儿携带的JAG1错义突变使JAG1蛋白功能受损,可能是Alagille综合征的致病原因。

法洛四联症患儿NOTCH2基因3'UTR区域突变分析

目的筛查法洛四联症(TOF)患儿中NOTCH2基因3'UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响NOTCH2基因表达的可能机制。方法选取152例诊断明确的TOF患儿(TOF组)为研究对象,107名健康儿童为对照组(CON组),PCR扩增NOTCH2基因3'UTR区域序列,所有扩增片段均进行双向测序。将所测NOTCH2基因3'UTR区序列与Gen Bank中的已知序列(NG_008163.1)通过BLAST程序对比,检出可能存在的基因突变。采用Pic Tar和Target Scan在线预测软件预测可能与NOTCH2基因3'UTR区域结合的微小RNA(miRNA),分析NOTCH2基因3'UTR区域突变对miRNA调控NOTCH2基因表达的影响。结果检测出NOTCH2基因3'UTR区域1个新发突变和5个已报道的单核苷酸多态性(SNP),分别为2 672位(157020T>G)、rs368873082(156595C>T)、rs835576(156691A>G)、rs3795664(156937C>T)、rs699779(156967T>C)和rs699780(156836T>C);5个已报道的SNP在TOF组与CON组中的等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。预测结果显示34种miRNA能与NOTCH2基因3'UTR区域结合,该突变并不位于34种miRNA与NOTCH2 3'UTR的结合区域。结论 NOTCH2基因3'UTR区域存在新突变157020T>G,该突变有可能通过空间构象影响miRNA与NOTCH2基因3'UTR区的结合效率,进而影响NOTCH2基因的正常表达;而该区域的5个SNP与TOF易感性无明显关联。

圆锥动脉干畸形患儿NOTCH1和JAG1基因3’非编码区变异分析

目的·探索NOTCH1和JAG1的3’非编码区(3’UTR)核苷酸变异与心脏圆锥动脉干畸形(CTD)的相关性。方法·采用病例-对照的研究方法,收集600名无22q11缺失的CTD患儿以及300名正常对照儿童。应用高通量测序技术直接检测样本人群NOTCH1和JAG1 3’UTR区段的序列,筛选变异位点,通过PCR和Sanger测序法验证变异的准确性。运用在线软件Target Scan、Pic Tar和micro RNA.org对变异位点进行功能预测分析。结果·检测出CTD患儿NOTCH1 3’UTR区存在1个新发突变和3个单核苷酸多态性(SNP),JAG1 3’UTR区存在3个新发突变和6个SNP位点。其中JAG1 3’UTR区有2个SNP位点(rs3840074、rs8708)的基因型在病例组和对照组间的分布差异有统计学意义(均P<0.05)。预测结果显示4个突变位点及2个有差异的SNP位点均可与微小RNA结合。结论·NOTCH1和JAG1 3’UTR区的核苷酸变异可能与心脏圆锥动脉干畸形的发生相关。