环腺苷酸拟似物8-CPT-cAMP诱导M2b型急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞分化的研究

为了解环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-CPT-cAMP)对M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)细胞的作用,以AML-M2b细胞株Kasumi-1细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、表面分化抗原、细胞周期分布以及对四氮唑蓝的还原能力的改变,研究8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞增殖及分化的影响,并应用半定量RT-PCR和Western blot检测药物处理前后Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合蛋白的变化。结果发现,8-CPT-cAMP(200μmol/L)可明显抑制Kasumi-1细胞增殖而促使细胞趋向分化,但这种分化不是典型的完全终末性分化,8-CPT-cAMP对Kasu-mi-1细胞内AML1-ETO融合基因及其编码蛋白的表达无显著影响。结论:8-CPT-cAMP对AML-M2b细胞具有诱导分化效应。

硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡机制的深入研究

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡的机制。通过细胞计数检测细胞增殖,用流式细胞仪分析细胞周期和活性氧(ROS)水平,Western blot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,10 nmol/L硼替佐米联合50 nmol/L阿糖胞苷对U937细胞有明显增殖抑制作用。两药联合协同诱导细胞凋亡。两药联合较单药处理能明显协同增加U937细胞ROS的水平,并能明显上调U937细胞中p-P38,p-JNK表达,下调p-ERK的表达。结论:硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡,其机制可能与ROS的损伤导致JNK、P38通路的激活和ERK的下调,从而影响细胞线粒体途径有关。

硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷诱导U937细胞凋亡的研究

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷(Ara-C)对U937细胞株的作用及机制。通过细胞计数,细胞形态学检查,流式细胞术和Western blot方法检测硼替佐米(10 nmol/L)和(或)Ara-C(50 nmol/L)处理前后U937细胞的增殖抑制和凋亡及其机制。结果显示,硼替佐米和Ara-C单药均能抑制U937细胞增殖,两药联合的抑制作用更加明显,细胞增殖抑制率在24和48 h分别达(55.00±2.81)%和(70.02±3.33)%;硼替佐米联合低浓度Ara-C能协同诱导U937细胞凋亡,促使线粒体跨膜电位下降,阳性细胞率达(38.70±1.54)%。两药联合应用还能协同诱导caspase-9,-8,-3的活化。结论:硼替佐米联合低浓度Ara-C主要通过线粒体途径、可能还通过死亡受体途径诱导U937细胞凋亡。

染色体构象捕获技术在造血分化调控研究中的进展

最新研究显示基因组空间结构对转录调控起着关键的作用。以造血分化过程为例,三维调控网络能更真实、精确地呈现造血特异的关键转录因子调控的组织方式和动态过程。革新的染色体构象捕获技术的发展和延伸为解析不同染色体间的调控元件、同一染色体内的不同调控元件以及核内染色质功能性组分之间的转录调控的空间结构提供了研究手段。本文详细介绍了染色体构象捕获技术和在此基础上衍生的高通量组学技术的发展,以及这些技术在造血分化过程中的应用。

PML-RARα对环腺苷酸诱导急性髓系白血病细胞分化的影响

为了进一步探讨环腺苷酸cAMP协同低剂量氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞分化的分子机制,以稳定转染了PML-RARα融合基因的PR9细胞为实验对象,通过观察细胞的生长,并利用形态学实验、流式细胞技术和荧光素酶报告基因转染实验等检测cAMP和/或氧化砷处理前后细胞相关指标的变化,研究PML-RARα在cAMP诱导AML细胞分化过程中的作用。结果显示,虽然cAMP单独能使表达PML-RARα的PR9细胞表面分化抗原CD11b的阳性率有所升高;但细胞形态学分析表明,cAMP单用无法诱导表达PML-RARα融合蛋白的PR9细胞分化,只有联合氧化砷才能使细胞表现出完全分化的特征,并伴有CD11b表达的显著升高。此外,PML-RARα还可以明显抑制含有cAMP反应元件的报告基因的转录。结论:PML-RARα融合蛋白对cAMP诱导AML细胞分化的信号转导途径具有显著的抑制作用。

三个遗传性血小板无力症家系的表型和基因型诊断分析

目的对3个遗传性血小板无力症(GT)家系进行临床表型和基因型诊断,探讨其分子发病机制。方法通过凝血指标检测、血小板(PLT)聚集试验、出血时间测定和流式细胞仪检测,明确3个遗传性GT家系的诊断,用PCR扩增先证者的αⅡb及β3基因的所有外显子及其侧翼序列,利用直接测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点,对其家系成员进行相应外显子基因检测,同时选择100名健康人对照以排除基因多态性。结果 3个家系的先证者血小板计数及凝血四项检测均正常,而出血时间(BT)延长;血小板对多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;流式细胞术检测结果显示,家系2及家系3先证者为Ⅰ型GT,家系1先证者为Ⅱ型GT。基因检测结果显示3个家系的基因突变均位于αⅡb基因,分别是17号外显子14502C>T导致R(Arg)553X(stop)纯合无义突变;26号外显子18859C>T导致Q(Gln)860X(stop)纯合无义突变;15号外显子14103-14104insT、14105A>C、14106G>C、14107A>T导致氨基酸移码突变;其家系部分成员检测到相应位点的杂合突变。结论纯合无义突变18859C>T、纯合插入突变14103-14104insT及3个纯合性错义突变14105A>C、14106G>C、14107A>T是导致先证者2及先证者3发生Ⅰ型GT的原因,而14502C>T纯合无义突变是先证者1发生Ⅱ型GT的原因。其中,纯合性插入突变14103-14104insT及纯合性点突变14105A>C、14106G>C、14107A>T为国际首次报道的新突变。

汉族人群蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性水平及活性缺乏发生率的研究

目的探讨蛋白C（PC）、蛋白S（PS）和抗凝血酶（AT）活性水平在中国汉族健康人群中的分布及其影响因素，观察此3种天然抗凝蛋白缺乏的发生率。方法国内四家医学中心参加此研究，采集汉族健康献血员或常规体检者的外周静脉血标本，分别测定血浆PC、AT和PS的活性，前两者采用发色底物法，后者采用凝固法。结果共募集3493名汉族志愿者。女性人群血浆PS和PC活性低于男性人群，以PS活性尤为显著（P〈0．01）；PC活性在不同性别人群均随年龄增长而增加，但在50岁后的男性人群中则呈下降趋势；PS活性在50岁前的人群中随年龄的变化不明显，但在50岁后的男性和女性人群中分别呈下降和上升趋势；AT活性在女性人群随年龄增长而逐步增加，而在50岁后男性人群明显下降。根据年龄和性别，PC、PS和AT缺乏的总发生率分别为1．15％、1．49％和2．29％。结论在中国汉族健康人群中，PC、PS和AT的活性水平受年龄和性别的影响明显，应根据年龄和性别制定参考值范围和判断是否存在活性缺陷。

蛋白C基因C64W和F139V突变致蛋白C缺陷的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因C64W、F139V和K150缺失突变（K150d）致PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和突变体表达质粒（PCwt、PC C64W、PC F139V、PC K150d）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色；用荧光实时PCR（real-time PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变；蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径；内糖苷酶-H（Endo H）酶切试验检测PC翻译后侧链糖化修饰。结果PC C64W未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解，PC F139V仅部分从细胞内分泌，大部分未分泌并在细胞内逐渐降解，PC K150d突变体蛋白的分泌未受突变的明显影响。real-time PCR结果显示，与野生型PC mRNA相比，突变体PC mRNA不降低；蛋白降解抑制实验显示，PC C64W和PC F139V通过蛋白酶体途径进行细胞内降解。Endo H酶切和转染细胞荧光染色显示，PC C64W和PC F139V主要位于前高尔基体。结论分泌障碍和细胞内降解是PC C64W和PC F139V导致PC缺陷症的原因，PC K150d对突变体蛋白的分泌无明显影响。

四个遗传性凝血因子V缺陷症家系临床表型和基因型变化的研究

目的研究4个遗传性凝血因子V（FV）缺陷症家系的临床表型和基因突变。方法测定家系成员活化部分凝血活酶时间（Am）、凝血酶原时间（PT）及FV促凝活性（FV：C）和FV抗原（FV：Ag）含量进行表型诊断；用PCR法扩增先证者F5基因的25个外显子及其侧翼序列，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。结果4例先证者APTF、PT明显延长，血浆FV：C和FV：Ag含量均显著降低。基因分析发现，先证者1的F5基因存在G16088C（Asp68His）杂合错义突变及4种位于同一条染色体上的杂合多态性T35788C（Met385Thr）、A47295G（His1299Arg）、A58668G（Met1736Val）和A74083G（Asp2194G1y）；先证者2的F5基因存在C46253T（Arg952Cys）和C46724T（Glnl109stop）两种纯合突变；先证者3的F5基因存在C67793G（Pro2006Ala）纯合错义突变；先证者4的F5基因存在C74022T（Arg2174Cys）纯合错义突变。结论Asp68His、Arg952Cys、Glnl109stop、Pr02006Ala和Arg2174Cys这5种突变，及Met385Thr、Hisl299Arg、Metl736Val和Asp2194Gly这4种多态性是导致相应先证者Ⅰ型遗传性FV缺陷症的原因。其中，Glnl109stop、Pr02006Ala和Arg2174Cys是国际上首次报道的新突变。

凝血因子ⅧTrp1707Ser突变患者相关抑制物的结合作用机制研究

目的对1例凝血因子Ⅷ（FⅧ）Trpl707Ser突变患者相关抑制物的结合作用机制进行探讨。方法对患者进行APTT、PT、纤维蛋白原和FⅧ活性（FⅧ：c）等血友病A相关检测；Bethesda法进行FⅧ抑制物检测；采用长链PcR（LD．PCR）和两组序列特异的PCR分别进行FⅧ基因内含子22倒位和内含子1倒位检测；采用核酸直接测序法对患者FⅧ基因各外显子及其侧翼序列进行检测；分别将含抑制物血浆与FⅧ重链及其片段（AI、A2）、轻链及其片段（A3、C1和c2）进行反应，加入等体积正常人混合血浆纠正后测定剩余FⅧ：C。以FⅧ片段作为抗原，生物素标记的经纯化的抑制物作为抗体与之反应，Westemblot法进一步验证抑制物与FⅧ各片段的结合反应。结果患者FⅧ：C为1．1％，临床诊断为血友病A，Bethesda法检测其体内FⅧ抑制物滴度达18．4BU，基因分析发现患者FⅧ基因14号外显子存在错义突变c．97223C〉G（p．Trp1707Ser）。纠正试验法检测显示含抑制物血浆分别与重链和轻链反应后，剩余FⅧ：C均有升高，且与重链反应时升高更明显；与重链的A2和轻链的c2片段反应后，也出现了剩余FⅧ：C升高。以还原变性的B区缺失重组FⅧ、A2和c2作为抗原，抑制物作为抗体时Western blot均能检测到相应条带，且重链相应的条带更深。结论FⅧTrp1707Ser突变相关抑制物结合FⅧ的位点位于重链的A2亚基和轻链的c2亚基，且与重链的结合能力更强。

纤维蛋白原γ链Arg275His突变所致异常纤维蛋白原的功能研究

目的对两个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的突变纤维蛋白原（Fg）进行功能研究。方法常规筛查凝血功能；Fg抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定；抽提DNA，对Fg3个基因（FGA、FGB和FGG）以及抗凝血酶基因（AT3）所有外显子及侧翼序列进行PCR扩增、测序及分析；采用常规血栓弹力图（TEG）和功能性FgTEG检查对家系B先证者及其父亲进行凝血功能的综合评价及血浆功能性Fg评估；应用Westernblot检测血浆赡肽链分子量；采用赡动态聚集曲线和纤维蛋白溶解曲线实验检测血浆Fg的功能。结果2例先证者凝血酶原时间（。rT）和爬虫酶凝固时间（RT）明显延长，Fg活性仅为0．5∥L和0．6g／L，但其抗原均正常，分别为2．32g／L和2．66g／L。两个家系先证者均存在1链Arg275His杂合突变，家系B先证者的祖父和姑母同时检出AT3g．5876T〉C（Serll6Pro）杂合突变。家系B先证者及其父亲TEG检测结果中α值分别接近和低于正常参考值范围下限，但最大波幅（MA值）均为正常；在功能性FgTEG检测中，MA值明显偏低。Fg动态聚集曲线中先证者和家系患者的起跳时间明显延长、峰值明显降低。纤维蛋白溶解曲线中多数患者的纤维蛋白在特定时间内不能被纤溶酶原完全溶解。结论首次发现遗传性异常纤维蛋白原血症合并AT缺陷的患者。1链Arg275His突变使Fg在纤维蛋白单体聚合以及纤维蛋白溶解方面出现异常。联合应用常规TEG和功能性TEG检测，可以更好地评估异常纤维蛋白原血症患者Fg的功能。

三个遗传性血管性血友病家系表型诊断和基因型研究

目的对3个遗传性血管性血友病（vWD）家系进行表型诊断和基冈型分析，探讨其分子发病机制。方法分别采用出血时间（BT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验（RIPA）、血管性血友病因子（vWF）瑞斯托霉素辅因子（vWF：RCo）、vWF抗原（vWF：锥）、vWF活性（vWF：A）测定，vWF胶原结合试验（vWF：CB），vWF与FⅧ结合试验（vWF：FⅧ：B）和多聚体分析对3例vWD先证者和家系成员进行表型诊断。提取3例先证者外周血基因组DNA，用PCR法扩增vWF基因的52个外显子及侧翼序列，通过直接测序分析vWF基因变异。结果3例先证者Am均延长，BT除先证苦3外均正常，血浆R1PA、vWF：RCo、vWF：Ag、vWF：A和vWF：CB均有不同程度的减低。多聚体分析结果显示先证者3中、高分子质量多聚体缺失，而先证者1、2基本正常。对3例先证者进千亍基冈测序，共发现3个杂合突变，分别为vWF基因的C144067A（112287Q）、GI10374A（R1374H）、CI10770T（S1506I，）以及28号外显子G110667A（D1472H）杂合多态性。结论R2287Q、R1374H和S15061．这3种杂合错义突变及D1472H杂合多态性足分别导致3例先证者发生遗传性vWD的分子发病机制。其中R2287Q是国际首次报道的新突变．

二例Ⅰ型抗凝血酶缺陷症患者反复发生静脉血栓的分子机制研究

目的对2例Ⅰ型抗凝血酶（AT）缺陷症家系进行表型诊断、基因分析，并探讨其静脉血栓发生的分子机制。方法常规筛查凝血功能，凝血酶生成试验评估高凝状态。用ELISA法及稀释的蝰蛇毒法分别检测抗心磷脂抗体（ACA）及狼疮抗凝物质（LA）。用发色底物法或凝固法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性（PC：A，PS：A及AT：A），用免疫比浊法检测抗凝血酶抗原（AT：Ag）。Western blot方法分析血浆中AT的含量及相对分子质量。用PCR方法扩增AT基因的全部外显子及侧翼序列，用DNA直接测序法进行基因分析，并对静脉血栓相关的基因多态性进行筛查。用定点突变法构建ATAla404Asp突变体表达质粒，脂质体介导瞬时转染293T细胞，检测细胞上清液和裂解液中AT：Ag。结果2例先证者的凝血筛查指标均未见异常，凝血酶生成试验显示先证者1的凝血酶生成潜力（ETP）和生成峰值分别为正常人的2．8倍和1．5倍，表明体内呈现明显高凝状态。PC：A、PS：A、ACA及LA检测均未见异常。先证者1、2的AT：A分别为45％和32％，AT：Ag分别为121mg／L和158mg／L。血浆Western blot结果显示2例先证者AT含量较正常混合血浆减少，但相对分子质量正常。基因分析发现2例先证者各携带一个杂合突变，分别为g．3291c—T（Thr9811e）和g．13863C→A（Ala404Asp），未发现静脉血栓相关的基因多态性。体外转染实验结果显示Ala404Asp突变质粒转染细胞的上清液和裂解液中的AT：Ag分别为野生型的4．8％和60．6％。结论Thi9811e和Ala404Asp两种AT突变与先证者1、2反复静脉血栓发生明显相关。其中Ala404Asp突变为国际首次报道。其分子发病机制研究显示Ala404Asp突变蛋白存在分泌障碍和细胞内降解增多，导致Ⅰ型AT缺陷症。

FⅧ His99Arg突变导致血友病A的分子发病机制研究

目的探讨1例临床出血表现与凝血因子Ⅷ活性（Fvm：C）检测结果明显不符的血友病A患者表型、基因型诊断及其分子发病机制。方法凝血、抗凝及纤溶相关指标检测，一步法及发色底物法检测FⅧ：C，ELISA法检测FⅧ的抗原（FVIH：Ag）。活化部分凝血活酶时间（APTr）纠正实验筛查FⅧ抑制物；PCR扩增先证者F8基因的所有外显子及其侧翼序列，利用直接核苷酸测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点，对其家系成员进行相应外显子基因检测；定点突变法构建B亚基缺失（760aa～1639aa）的人FⅧHis99Arg和His99Ala两种突变的表达质粒（pRC／RSV—BDhFⅧcDNA），两种突变质粒分别瞬时转染HEK293T细胞，测定细胞上清液中的FⅧ：C和细胞上清液及裂解液中的FVIU：Ag。结果先证者APTT延长，一步法及发色底物法检测的FⅧ：C均低于1．0％，血浆FⅧ：Ag为120．0％。APTT纠正试验阴性，其他凝血、抗凝及纤溶相关检测均未见异常。诊断为交叉反应阳性（CRM＋）的血友病A。患者F、8基因直接核苷酸测序发现3号外显子存在28828A→G突变，导致His99Arg氨基酸改变，其母亲该位点为杂合突变。体外表达研究结果显示细胞上清液中His99Arg突变蛋白FⅧ：Ag及FⅧ：C分别为野生型的180．0％及5，8％，His99Ala突变蛋白FⅧ：Ag及FⅧ：C分别为野生型的45．0％和20．0％。Western blot显示，His99Arg突变质粒表达上清液中FⅧ蛋白含量较野生型明显增高，而His99Ala突变质粒表达上清液FⅧ蛋白含量较野生型减少。提示His99Arg为CRM＋血友病A突变而His99Ala为CRM-血友病A突变。结论体外检测发现His99Arg和His99Ala两种FVI能够表达，但常规凝血检测His99Arg突变FⅧ基本无功能，而His99Ala凝血功能也降低。

四例遗传性异常纤维蛋白原血症患者基因型和凝血功能分析

目的研究遗传性异常纤维蛋白原血症患者表型、基因型及功能。方法对4例遗传性异常纤维蛋白原血症患者及其家系成员行常规凝血及抗凝检测。分别用免疫比浊法和Clauss法测定血浆纤维蛋白原（Fg）抗原和活性，用Western blot法检测Fg三条肽链的分子量；分别进行血浆Fg凝固率、Fg动态聚集功能、纤维蛋白动态溶解功能检测；抽提患者及家系成员DNA，PCR扩增Fg3个基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列，DNA直接测序并进行基因分析。结果4例患者活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）以及抗凝指标（抗凝血酶活性、蛋白C活性和蛋白S活性）均正常，凝血酶时间（TT）和蕲蛇酶时间（RT）明显延长；Fg活性降低（分别为0．54、0．52、0．43和0．50g／L），Fg抗原基本正常（分别为2．0、2．9、1．7和2．3g／L）；Western blot未检测到异常条带；患者血浆Fg凝固率降低至50％左右；Fg动态聚集开始时间延迟、最大聚集率下降；纤维蛋白凝块溶解速率降低；基因分析发现4例患者均发生了Ad链16位精氨酸的改变，3例为FGAg．1203G—A，导致Arg16His杂合错义突变，1例为FGAg．1202c—T，导致Arg16Cys杂合错义突变。结论4例患者Fg分子的凝固率降低、聚集和纤溶功能异常均由A“链16位精氨酸杂合错义突变所致。

三个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的表型和基因型分析

目的对3个遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行临床表型和基因型分析。方法检测3个家系所有成员外周血活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TF）、靳蛇酶时间（RT）、抗凝血酶活性（AT：C）、蛋白C活性（PC：C）和蛋白S活性（PS：C），纤维蛋白原（Fg）抗原和活性分别用免疫比浊法和Clauss法测定，分别用SDS—PAGE和Western blot法检测3例先证者血浆纤维蛋白原三条肽链的相对分子质量。抽提DNA，PCR扩增Fg3个基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列，DNA测序并进行基因分析。结果3例先证者APTT、PT以及抗凝指标（AT：C、PC：C和PS：C）都正常，而TT和RT明显延长，如的活性降低，分别为0．90、0．84及0．44g／L，而抗原正常，分别为2．0、3．2及3．1g／L；SDS—PAGE和Western blot法均未检测到异常条带。基因分析发现3例先证者各携带1个杂合错义突变，分别为FGGg．7476G→A（γArg275His）、FGAg．1209C→T（Aα Pro18Leu）和FGA g．1202 C→T（Aα LArg16Cys）。结论3例先证者遗传性异常纤维蛋白原血症分别由γ Arg275His、Aα Pro18Leu和Aα Arg16Cys突变所致，其中Aa Pro18Leu和Aα Arg16Cys突变为国内首次报道。

Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症两种新基因突变

目的对两例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断，并探讨其分子发病机制。方法检测凝血与抗凝指标，并进行易栓症筛查和表型诊断。采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员AT抗原（AT：Ag）和AT活性（AT：A），抽提外周血基因组DNA，PCR扩增AT基因（GI号28906）7个外显子及其侧翼序列、5’及3’端非翻译区，利用直接测序法进行基因序列分析。针对先证者的突变位点，对其家系成员进行相应基因突变检测，同时在正常人群中筛查以排除多态性。结果先证者1和先证者2AT：Ag分别为126mg／L和117mg／L，AT：A分别为49％和48％。先证者1和先证者2的AT基因2号外显子分别发现了杂合缺失突变3239～3240delCT和杂合无义突变3206A—T（K70Stop），其家系部分成员检测到相应的杂合突变。结论两例先证者均为Ⅰ型遗传性AT缺陷症，由AT基因3239—3240delCT和3206A→T（K70Stop）突变所致。

血小板膜糖蛋白ⅡbL721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制

目的探讨血小板膜糖蛋白ⅡbL721R和Q860X复合杂合突变导致血小板无力症的分子机制。方法应用PCR法对先证者αⅡb和β3基因所有外显子及其侧翼序列进行扩增；PCR产物纯化后直接测序，检测其突变基因。突变位点经直接测序证实排除基因多态性。采用PCR定点突变法构建αⅡbL721R和Q860X突变真核表达载体，测序正确后用脂质体将其分别与表达β3亚基的真核表达载体共转染293T和CHO细胞。采用流式细胞术检测转染细胞膜上αⅡbβ3的表达，用Western blot法鉴定αⅡbL721R和Q860X突变体在转染细胞内的总体表达，采用免疫荧光共聚焦显微镜确定αⅡbL721R和Q860X突变体的细胞内定位。结果先证者在αⅡb基因存在T2255G（L721R）和C2671T（QS60X）复合杂合突变。PCDM8ⅡbL721R／PCDM8Ⅲa转染的293T细胞表面αⅡb为野生型的2．1％，β3为野生型的11．0％。PCDM8ⅡbQ860X／PCDM8Ⅲa转染的293T细胞表面αⅡb为野生型的31．9％，133为野生型的18．0％。Western blot法证实突变αⅡbL721R与β3共表达后，可检测到前体αⅡb（pro-αⅡb），但未检测出成熟αⅡb Q860X与β3共表达后，检测到截短型αⅡb蛋白。免疫荧光细胞内共定位研究显示L721R和Q860X突变αⅡbβ3蛋白大部分分布于内质网，仅有少量在高尔基体中。结论αⅡbL721R和Q860X突变不影响αⅡb蛋白的合成和pro-αⅡβ3复合物的形成，但阻碍了pro—αⅡbβ3复合物由内质网向高尔基体的转运，导致细胞内滞留，从而影响了αⅡbβ3在细胞表面的表达，是导致血小板表面缺乏αⅡbβ3复合物、产生血小板无力症的分子机制。

L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ基因表达的影响

目的研究L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因转录及表达的影响。方法将B结构域（氨基酸760～1639）缺失的人FⅧcDNA（BDDhFⅧcDNA）插入至质粒载体pcDNA6／V5-HisA，构建重组载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ，转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h后，用ELISA方法检测细胞上清液中的人FⅧ抗原（FⅧ：Ag），一期凝血酶法检测FⅧ的促凝活性（FⅧ：C）。用Northern blot检测HUVEC中人FⅧ基因的转录。用PCR扩增BDDhFⅧcDNA的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因，分别插入至pcDNA6／V5-HisA，构建五种载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ-A1、pcDNA6／V5-BDDhF Ⅷ-A2、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-A3、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C1和pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C2，分别转染HUVEC后，加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h。膨胀裂解法分离细胞核，进行细胞核连缀（Run-on）反应，狭线印迹杂交检测A1、A2、A3、C1和C2结构域基因的转录。结果经L-精氨酸诱导后，HUVEC中人FⅧ基因表达明显增强[FⅧ：Ag为（146．08±4．78）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．752±0．009）U／ml]，约是未经L-精氨酸诱导[FⅧ：Ag为（34．66±3．98）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．171±0．006）U／ml]的4倍（P〈0．01）。Northern blot检测显示，加L-精氨酸培养之后，HUVEC中人BDDFⅧ mRNA的转录也较未加L-精氨酸显著增强，而只转染pcDNA6／V5-HisA的HUVEC中无人BDDFⅧ mRNA的转录存在。Run-on及狭线印迹杂交显示，加L-精氨酸培养后，A1和A2结构域基因的转录均较未经L-精氨酸诱导者明显增强，也显著强于A3、C1和C2结构域基因的转录，而A3、C1和C2结构域基因的转录在L-精氨酸诱导前后均无明显变化。结论L-精氨酸通过促进人FⅧ的A1和A2结构域基因的转录进而增强FⅧ在体外的转录和表达，因而在血友病A的基因治疗研究中，L-精氨酸是一个很有前途的诱导FⅧ转录和表达的物质。

体外表达探讨凝血因子IXArg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制

目的探讨凝血因子Ⅸ（FIX）Arg327Ile（R327I）突变导致血友病B的分子发病机制。方法在野生型FIX表达质粒FIX”peDNA3．1（一）的基础上，定点突变法构建FIXR327I、R327Ala（A）、R327Lys（K）和R327Asn（N）突变的表达质粒，重叠PCR构建FIX324～329（B折叠结构域）换成FVIl298～303同源结构突变表达质粒[FⅨBFVIIpeDNA3．1（一）]。将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞，一期法检测培养上清液中FIX活性（FIX：C）及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原（FⅨ：Ag），Westernblot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平。荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌。结果体外瞬时转染FIXR327I突变基因的细胞FIX：C为正常野生型的4．49％，细胞上清液和细胞裂解液FIX：Ag水平分别为野生型的31．02％和129．29％，为交叉反应减低型（CRMR）。活细胞免疫荧光观察发现FIXR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高，并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多。FIXR327A、R327K、R327N及FIXl3FVII突变基因转染的细胞FIX：c水平较野生型减低，其中以FIXl3FVII突变降低最为明显；转染的细胞培养上清FIX：Ag水平除R327K突变型较野生型增加，其余突变型均比野生型有不同程度的降低。Westernblot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低。结论FIXR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌，R327位点与FⅨ功能特异有关，其所在的B折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用。