凝血因子ⅧTrp1707Ser突变患者相关抑制物的结合作用机制研究

目的对1例凝血因子Ⅷ（FⅧ）Trpl707Ser突变患者相关抑制物的结合作用机制进行探讨。方法对患者进行APTT、PT、纤维蛋白原和FⅧ活性（FⅧ：c）等血友病A相关检测；Bethesda法进行FⅧ抑制物检测；采用长链PcR（LD．PCR）和两组序列特异的PCR分别进行FⅧ基因内含子22倒位和内含子1倒位检测；采用核酸直接测序法对患者FⅧ基因各外显子及其侧翼序列进行检测；分别将含抑制物血浆与FⅧ重链及其片段（AI、A2）、轻链及其片段（A3、C1和c2）进行反应，加入等体积正常人混合血浆纠正后测定剩余FⅧ：C。以FⅧ片段作为抗原，生物素标记的经纯化的抑制物作为抗体与之反应，Westemblot法进一步验证抑制物与FⅧ各片段的结合反应。结果患者FⅧ：C为1．1％，临床诊断为血友病A，Bethesda法检测其体内FⅧ抑制物滴度达18．4BU，基因分析发现患者FⅧ基因14号外显子存在错义突变c．97223C〉G（p．Trp1707Ser）。纠正试验法检测显示含抑制物血浆分别与重链和轻链反应后，剩余FⅧ：C均有升高，且与重链反应时升高更明显；与重链的A2和轻链的c2片段反应后，也出现了剩余FⅧ：C升高。以还原变性的B区缺失重组FⅧ、A2和c2作为抗原，抑制物作为抗体时Western blot均能检测到相应条带，且重链相应的条带更深。结论FⅧTrp1707Ser突变相关抑制物结合FⅧ的位点位于重链的A2亚基和轻链的c2亚基，且与重链的结合能力更强。