3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型和基因型关系的研究

目的探讨遗传性抗凝血酶缺陷症家系表型和和基因型的关系。方法对3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系（家系1~3）作表型和基因型诊断：常规检测活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（Fg）、凝血酶时间（TT）以筛查凝血功能,发色底物法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性（PC∶A,PS∶A及AT∶A）,免疫比浊法检测抗凝血酶抗原（AT∶Ag）,Western blot检测血浆中抗凝血酶的分子量和含量;PCR扩增AT基因所有外显子及侧翼序列,DNA测序并进行基因分析。针对新基因突变,在100例正常人中检测相应突变以排除多态性,用TA克隆PCR产物测序鉴定杂合碱基缺失突变。结果 3名先证者均为反复发作的静脉血栓患者,凝血指标及PC∶A和PS∶A都正常,AT∶A分别为正常人（100%）的60%、52%和60%,AT∶Ag分别为16.9、14.1和11.4 mg/dl,Western blot显示3位先证者的血浆AT蛋白分子量正常（58 kD）而含量低于正常;基因分析发现3名先证者各携带1个杂合突变,分别为g.8263 C〉T（Leu340Phe）、g.5894-6 del TTC（Phe122del）和g.5898 T〉G（Phe123Cys）。3个家系中与先证者表型相似的成员,则携带有相同的AT基因突变;但除家系2先证者的父亲有静脉血栓外,家系1和3中含有相应AT基因突变的家庭成员均无血栓发生。结论 3名先证者遗传性抗凝血酶缺陷症分别由Leu340Phe、Phe122del和Phe123Cys突变所致,其中Leu340Phe和Phe123Cys突变为国际上首次报道。

HT29和HCT116结肠癌细胞无血清培养形成肿瘤干细胞球特性的差异性研究

目的比较HT29和HCT116两种结肠癌细胞系中肿瘤干细胞的差异,初步探讨结肠癌干细胞研究模型。方法以无血清培养法培养HT29和HCT116细胞,观察其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异,用限制性稀释法计算两者的成球率;流式细胞术分析HT29和HCT116细胞系中CD44/CD24的表达情况;裸鼠体内成瘤实验鉴定HT29细胞球与HCT116细胞球成瘤能力。结果无血清培养法发现HCT116较HT29更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短,即HT29在无血清培养的第7天开始形成规则的球体,而HCT116则在第5天就已形成规则的球体,HCT116成球率(11.4±1.15)%高于HT29(3.31±0.27)%,且差异有统计学意义(P<0.05);HT29和HCT116中CD44±/CD24±各细胞含量有显著差异,结果显示具有干细胞特性的CD44+/CD24-结肠癌细胞在HCT116中所占比例(60.33±5.75)%明显高于HT29(9.23±2.15)%,差异有统计学意义(t=13.939,P<0.05);体内成瘤实验发现HCT116细胞球在裸鼠体内的成瘤能力明显强于HT29细胞球,HCT116细胞球的成瘤速度及瘤体生长速度都较HT29细胞球快。结论与HT29相比,HCT116结肠癌细胞系更适合作为肿瘤干细胞研究的模型。

His99Arg突变患者血浆凝血因子Ⅷ活性的稳定性研究

目的探讨His99Arg突变致患者血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性检测结果变化大及一期法和二期法FⅧ活性检测结果不相符的分子发病机制。方法以凝固法检测先证者及家系成员凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),FⅧ活性(FⅧ∶C)、FⅨ∶C等。基于APTT途径的一期法和基于发色底物法途径的二期法检测FⅧ∶C,测定患者血浆分别在37、25、4、-20及-80℃时的FⅧ∶C,测定56℃时患者血浆FⅧ∶C稳定性(一期法)及FⅧ蛋白的热稳定性(EILSA法);以长链PCR及序列特异PCR检测F8基因内含子22及内含子1倒位,对F8基因所有外显子及其侧翼序列测序;以PyMOL软件分析FⅧ突变蛋白的三维结构;构建His99Arg突变表达载体,转染HEK293T细胞后博莱霉素筛选稳定表达细胞株,测定培养上清FⅧ∶C稳定性。结果先证者血浆FⅧ∶C:一期法检测为14.7%,二期法检测为1.2%。和正常人相比,患者血浆在室温放置<2 h时FⅧ∶C迅速下降,>2 h后FⅧ∶C基本稳定在1%左右;在4℃孵育时FⅧ∶C下降的趋势和室温放置时基本相似;FⅧ∶C在37℃随孵育时间延长而明显下降,孵育10 min后FⅧ∶C下降了93.9%;不管在-20还是在-80℃,患者血浆放置1个月后,其FⅧ∶C基本完全丧失;56℃时患者血浆FⅧ∶C的半衰期仅为正常人的1/4(2 min/8 min);在56℃时患者FⅧ稳定性下降明显,重链和轻链解离速度是正常人的3倍(2 min/6 min)。F8基因分析发现患者存在g.30716A>G突变而导致His99Arg氨基酸改变;三维结构模型分析显示His99Arg突变后,Arg99残基与His1957及Ser1959残基间的距离由3.49和3.42分别变为4.19和2.39。体外表达研究显示培养上清液中的FⅧ具有与患者血浆FⅧ相似的不稳定表现。结论 His99Arg突变引起FⅧ空间结构发生变化和FⅧ重链和轻链解离速度加快。His99Arg突变后FⅧ∶C的稳定性明显下降,造成常规条件下FⅧ∶C检测结果变化大及一期法和二期法FⅧ∶C检测结果的不相符。

干扰素调节因子家族与肿瘤

干扰素调节因子家族是一大类对干扰素起调控作用的转录因子的统称。长期以来，人们一直认为干扰素调节因子（IRF）通过调节干扰素的表达而行使其抗病毒、应激、免疫调节功能。事实上，许多IRF对凋亡、细胞周期、细胞分化、肿瘤发生也起着重要的调节作用，尤其是IRF在肿瘤中的作用倍受关注，本文就它们之间的关系作一综述。