PLGA-Fibrin杂合支架构建及与脂肪源性干细胞复合成软骨的研究

目的：探讨在特定的软骨细胞诱导培养液中，由纤维蛋白（fibrin）修饰的聚乳酸／聚羟基乙酸共聚物（PLGA）杂合支架材料对脂肪源性干细胞成软骨的影响。方法：PLGA支架材料采用快速成形技术制备；PLGA-Fibrin杂和支架材料采用低温冷冻的方法制备。分离兔脂肪源性干细胞，分别种植在未修饰的PLGA支架材料和Fbirin修饰的PLGA上，并在特定软骨诱导液中培养至14d，分别应用SEM观察杂合支架材料的性能；生化方法检测硫酸软骨素的含量；支架材料的亲水性和细胞黏附能力也被检测。通过体内实验对两种支架材料与干细胞复合修复软骨缺损的性能进行形态学染色和评分。结果：体外研究表明，与未修饰的PLGA支架材料相比，Fibfn修饰的PLGA亲水性明显被提高，同时也提高了干细胞在杂合支架材料上的黏附性能和硫酸软骨素的含量。软骨损伤修复研究表明，脂肪源性干细胞与Fibirn修饰的PLGA支架材料复合后，具有良好的修复软骨缺损的功能，其性能明显优于单纯的PLGA材料复合干细胞。结论：Fibim修饰的PLGA支架材料可提高脂肪源性干细胞向软骨细胞分化的能力，促进缺损软骨的再生。

颈椎单节椎体平移错缝对颈椎主要结构应力影响的有限元分析

目的:探讨颈椎单节椎体平移错缝对颈椎主要结构应力的影响。方法:选取1名无颈部病变的健康志愿者,采用GE 64层螺旋CT机对该志愿者进行层厚0.625 mm的螺旋扫描及断层图像处理,扫描范围为颅底至C 7椎体下缘。基于CT扫描数据,应用三维有限元建模处理软件建立正常颈椎三维有限元模型,并对模型进行有效性验证。基于建立的正常颈椎三维有限元模型,通过对各特定节段椎体分别进行平移运动(位移1.5 mm,不超过椎间盘1/4),模拟颈椎单节椎体平移错缝,获得颈椎单节椎体平移错缝三维有限元模型。基于Abaqus6.10有限元分析软件观察颈椎单节椎体平移错缝对椎动脉、脊髓、关节突关节、椎间盘等颈椎主要结构应力的影响。结果:①正常颈椎三维有限元模型验证结果。本研究所建立的正常颈椎三维有限元模型涉及744628个单元、248212个节点;模型外观逼真,包含了颈椎椎体、椎板、棘突、横突、关节突、椎间盘、椎动脉、脊髓、韧带等重要解剖结构。模型具有良好的活动度,其前屈、后伸、侧屈、旋转活动度与经典文献报道的数据基本一致。②颈椎单节椎体平移错缝对颈椎主要结构应力的影响。颈椎单节椎体平移错缝会对椎动脉、脊髓、关节突关节及椎间盘的应力产生影响。C 2平移错缝时椎动脉增加的应力最大(42.81 Pa),C 6次之(30.62 Pa),C 5最小(21.19 Pa)。C 6平移错缝时脊髓增加的应力最大(32.12 Pa),C 5次之(30.46 Pa),C 1最小(5.59 Pa)。颈椎单节椎体平移错缝会对其上、下位关节突关节及椎间盘的应力产生影响,其下位关节突关节和椎间盘的应力大于上位关节突关节和椎间盘的应力。结论:颈椎单节椎体平移错缝后,椎动脉、脊髓、关节突关节及椎间盘等颈椎主要结构的应力均会受到影响。

有限元分析颈椎棘突骨折内固定有效性

通过对颈椎棘突骨折(累及椎板)内固定治疗有限元模型的建立和分析,明确此种治疗方式对颈椎棘突骨折的有效性。先建立正常全颈椎(C0-T1)的有限元模型并与文献报告进行对比验证,模型验证后,在正常模型基础上建立颈椎棘突骨折(累及椎板)模型,并模拟直型接骨板行内固定治疗,测量并比较颈椎棘突骨折模型及手术内固定模型和原始正常模型在前屈、后伸、左右侧弯、左右旋转6种条件下活动度改变。以及颈椎各结构的应力变化。结果表明,在正常模型上结合临床病例建立的颈椎棘突骨折(累及椎板)外观逼真,生物力学相似度良好。骨折模型部分节段,主要为C7-T1的活动度(前屈+后伸9.20°,左右侧弯5.83°,左右旋转13.12°)较正常模型(前屈+后伸7.11°,左右侧弯4.92°,左右旋转9.59°)增大,尤其是旋转活动度,模拟植入内固定后稳定性增加(前屈+后伸4.07°,左右侧弯2.21°,左右旋转2.91°),且内固定钢板应力分析提示,承受最大应力值在安全范围。颈椎棘突骨折(累及椎板)及内固定模型可以较好地模拟临床实际病例,通过有限元分析预示,此型骨折存在潜在不稳的可能性,探讨微型棘突钢板在骨折手术治疗中的应用,具有一定的临床参考价值。

黄芪对脂肪源性干细胞成骨作用的初步探讨

目的探索黄芪对脂肪源性干细胞(ASCs)成骨能力的影响,为诱导ASCs向成骨分化提供一个更好的体外环境。方法复苏人ASCs细胞,当细胞生长至融合时传代,取第3代人ASCs用成骨诱导液进行培养,取第4代用于实验。实验共分为三组:空白组(完全培养基干预ASCs)、诱导组(成骨诱导液干预ASCs)和黄芪组(黄芪注射液与成骨诱导液按体积1.5∶8.5配制干预ASCs)。采用MTT检测细胞增殖情况;RT-PCR检测成骨相关指标碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原(Collagen I)mRNA的表达。结果 MTT表明在早期(3d)诱导组和黄芪组均促进了细胞增殖,与空白组相比差异有统计学意义(P<0.05);随着干预时间的延长,诱导组和黄芪组细胞增殖速度反低于空白组,空白组增殖情况明显优于诱导组和黄芪组(P<0.05)。RT-PCR表明诱导组和黄芪组均可促进ALP(0.42±0.02)、(0.61±0.01)和Collagen I(0.39±0.09)、(0.56±0.18)的表达,与空白组(0.23±0.06)、(0.11±0.03)相比差异有明显的统计学意义(P<0.05);黄芪组与诱导组相比差异也有明显的统计学意义(P<0.05)。结论黄芪具有明显的促进干细胞向成骨细胞分化的作用,为黄芪参与骨缺损修复提供了一定的实验资料。

染氟兔椎体骨组织形态计量参数与MRI信号强度相关性的研究

目的 分析染氟兔腰椎椎体骨和骨髓组织形态计量参数的特点及其与MRI信号强度的相关性。方法 采用40例3月龄新西兰白兔随机分为染氟组（30只）和对照组（10只）,每组雌雄各半。用城市自来水每升加入100 mg氟化钠（氟含量100 mg/L）作为饮用水对染氟组兔染氟180 d,30只中获完整资料24只（雄性10只,雌性14只）;用相同城市自来水（氟含量〈0.9 mg/L）作为对照饮用水,10只中获完整资料8只（雌雄各半）;依腰椎MRI信号强度对染氟并获完整资料的24只分为敏感型和抵抗型。分析椎体骨组织形态计量参数及其与MRI信号强度的相关性,以及MRI诊断早期氟骨症的敏感度和预测氟骨症易感性的可行性。结果 椎体骨小梁容积（trabecular volume,BV）、骨髓造血细胞容积（hemopoietic volume,HV）和间质积液容积（fluid volume,FV）分别与总海绵组织容积（total spongy tissue volume,TV）的比值为18.3%±2.6%、45.2%±6.0%和10.4%±5.7%,对照组分别为14.5%±2.8%、36.3%±7.3%和6.2%±2.1%,染氟组各比值明显高于对照组;脂肪细胞容积（adipocyte volume）与TV的比值,染氟组（26.0%±8.0%）明显低于对照组（43.3%±5.6%）。染氟的24只兔中发现敏感型2只（8.3%,2/24）,抵抗型22只（91.7%,22/24）。BV/TV、HV/TV和FV/TV值,从大到小依次为敏感型、抵抗型、对照组,AV/TV值的变化则相反。MRI信号强度,敏感型T1加权成像（T1 weighted imaging,T1WI）的对比噪声比（contrast to noise ratio,CNR）最小,其次是抵抗型,对照组最大。脂肪饱和法T2加权成像（fat-saturated T2 weighted imaging,FsT2WI）的CNR变化则相反。T1WI与AV/TV值呈正相关,与FV/TV和BV/TV值呈负相关;FsT2WI与FV/TV、BV/TV值呈正相关,与AV/TV值呈负相关。T1WI诊断早期氟骨症椎体CNR界值取≤ 23.2,其敏感度为83.3%,特异度为100%;FsT2WI的CNR界值取 ≥5.7,其敏感度为45.8%,特异度100%。结论 早期氟骨症的特点主要是骨髓脂肪组织细胞增加和骨髓间质积液,即骨髓氟中毒,与MRI信号强度改变相关。

注射型支架与脂肪源性干细胞复合成软骨的研究

目的探讨在特定的软骨细胞诱导培养液中,由纤维蛋白和硫酸软骨素复合所构建的新型注射型支架材料对脂肪源性干细胞向软骨细胞分化的影响。方法分离兔脂肪干细胞,分别种植在纤维蛋白与纤维蛋白和硫酸软骨素复合的两种胶体支架材料上,并在特定软骨诱导液中培养14d。应用MTT检测细胞增殖,生化方法检测硫酸软骨素的含量,RT-PCR检测Ⅱ型胶原的表达,形态学染色和扫描电镜观察细胞形态及细胞与支架材料的生物相容性。结果脂肪源性干细胞在纤维蛋白与纤维蛋白和硫酸软骨素复合的两种胶体支架材料上均呈现出软骨细胞的表型,较之单纯的纤维蛋白载体,由纤维蛋白和硫酸软骨素复合所构建的新型注射型支架材料更有利于脂肪源性干细胞增殖与表达硫酸软骨素和Ⅱ型胶原等软骨细胞表型,向软骨细胞分化。结论纤维蛋白和硫酸软骨素复合所构建的新型注射型支架材料具有促进脂肪源性干细胞向软骨细胞分化的作用,并表现出可能应用于关节软骨修复的潜在价值。

IGF-1、IGF-1R及Bcl-2,Bax在大鼠髁突软骨发育中的表达及作用

目的探讨大鼠髁突软骨发育过程中IGF-1、IGF-1R及凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达、分布以及可能发挥的作用。方法获取出生后1、7、14、28d SD大鼠髁突,甲苯胺蓝染色观察软骨结构。免疫组化染色检测IGF-1、IGF-1R、Bcl-2、Bax在各年龄组SD大鼠髁突软骨的分布。Western blot及real-time PCR分别检测各年龄组软骨细胞内IGF-1、IGF-1R、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表达。结果甲苯胺蓝染色结果显示随年龄递增,大鼠髁突软骨逐渐变薄,宽度增加。免疫组化染色显示IGF-1、IGF-1R、Bcl-2在增殖层至肥大软骨细胞浅层分布最明显,Bax主要表达在成熟层及肥大层。Real time PCR及Western blot结果表明出生后的IGF-1 mRNA的表达逐渐降低,至28d时表达开始增强,IGF-1R蛋白及mRNA出生后稍有波动但表达相对平稳,Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达逐渐增强,至出生14d时表达开始下降(P<0.05)。结论 IGF-1、IGF-1R及凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达及分布相关,共同参与调控髁突软骨的发育。

丹参注射液对C57小鼠脂肪源性干细胞成软骨的促进作用

目的:探索丹参注射液对脂肪源性干细胞(ASCs)成软骨的促进作用。方法:①获取C57小鼠ASCs并培养传代,取第4代用于体外实验。分为空白组、诱导组与丹参注射液组,分别予常规培养液、成软骨诱导液及成软骨诱导液加丹参注射液干预,培养14 d后采用定量PCR检测ASCs体外Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)的表达。②取2月龄裸鼠15只,在髌股关节面用克氏针造成软骨缺损。随机分为模型组、诱导细胞复合纤维蛋白胶植入组和丹参注射液干预细胞复合纤维蛋白胶植入组,术后12周切取膝关节缺损处,行HE染色。结果:①通过体外对CollagenⅡmRNA表达的研究证实,诱导组和丹参注射液组均可促进ASCs向软骨细胞分化,尽管两者数值相比没有统计学差异(P>0.05),但与诱导组相比丹参注射液组可以提高CollagenⅡmRNA的表达水平。②体内修复的HE染色表明,丹参注射液组和诱导组与纤维蛋白胶复合后均具有促进软骨再生,其中丹参注射液干预细胞组的再生软骨优于诱导组。结论:丹参注射液具有促进ASCs向软骨细胞分化的功能,与支架材料复合后可以较好地修复软骨缺损,这将为中药应用软骨组织工程的发展奠定基础。

川芎嗪对骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖及VEGF基因表达的影响

目的:探索川芎嗪对骨肉瘤细胞株SaOS-2增殖及血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因表达的影响,为采用中医药治疗骨肉瘤奠定理论基础。方法:复苏人骨肉瘤细胞株SaOS-2,当细胞生长至融合时传代。实验分为空白对照组及5%、10%、15%川芎嗪干预组。采用CCK-8检测川芎嗪对细胞增殖的抑制情况;RT-PCR检测VEGF基因的表达。结果:CCK-8检测结果表明,在不同时间点、不同浓度的川芎嗪对SaOS-2细胞的生长均有抑制作用,并随着川芎嗪浓度的增高,其作用时间越长、抑制作用越明显(P<0.05);RT-PCR表明,川芎嗪各组之间没有明显有效的抑制VEGF基因的表达(P>0.05),但从数值上分析可发现随着川芎嗪浓度的增高,VEGF基因的表达呈降低的趋势。结论:川芎嗪可以有效地抑制骨肉瘤细胞株SaOS-2的增殖,但不能有效抑制VEGF的基因表达。

Smad3介导补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响

目的:探讨smad3是否介导了补肾中药对增龄成骨细胞VDR mRNA表达的影响,从而阐明补肾中药具有促进骨形成的机制。方法:分离6月龄和16月龄SD大鼠成骨细胞,采用组织块翻转方法培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并以矿化结节染色对成骨细胞加以鉴定。将SD大鼠随机分为正常组、生理盐水组、单味补阳组(固本壮骨粉)、复方补阳组(金匮肾气丸)、复方平补组(补肾益精方)、复方补阴组(知柏地黄丸)和西药对照组(阿法骨化醇片),制备药物血清;当成骨细胞汇合达60%,换无血清培养液培养细胞24 h后,加入含药血清(浓度为10%)再继续培养3 d。采用RT-PCR方法检测含药血清干预后成骨细胞smad3和VDR mRNA的表达。结果:在增龄成骨细胞smad3 mRNA表达是下降的,这与增龄所致VDR mRNA表达下降相一致;单味补阳组、复方补阳组和西药对照组上调smad3 mRNA的趋势与它们上调VDR mRNA的趋势相一致。结论:补阳中药可能通过启动Smad3 mRNA表达而上调VDR mRNA表达,从而促进骨形成。