小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的构建共表达小鼠Wnt3a(mWnt3a)与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-Zs-Green1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组(GFP-NSCs组)和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d,Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组(P<0.01)。结论成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。

绿色荧光蛋白转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究

目的:体外分离、培养、鉴定绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因胚胎大鼠神经干细胞,研究其体外活性与生物学性状,为在体分化示踪研究奠定基础。方法:采用机械分离,无血清传代培养法从GFP胚胎大鼠海马获得神经干细胞,免疫荧光和免疫细胞化学法染色进行体外神经干细胞性质和分化活性鉴定,并利用流式细胞计数法行纯度检测。结果:成功从GFP胎鼠海马获得神经干细胞,体外生长情况与活性良好,能分化成神经元和胶质细胞;体外连续传代3次后绝大部分细胞Nestin表达阳性,且分化后细胞的GFP表达不受影响。结论:GFP胚胎大鼠来源神经干细胞具有普通胎鼠神经干细胞相同的自我更新和多向分化潜能,且能稳定表达GFP,因此它可以成为示踪神经干细胞研究的有效工具细胞。

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P<0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。

Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究

目的探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法采用机械分离、无血清传代培养法从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对其干细胞特性及其受体Fzd3蛋白表达进行鉴定,观察Wnt3a对NSCs体外分化的影响。结果海马NSCs表达特异性标志物巢蛋白及胞膜蛋白Fzd3;体外诱导分化,Wnt3a处理组神经元及星形胶质细胞分化的比例分别为11.25%±0.62%和56.26%±4.82%,而对照组则为8.54%±0.48%和68.42%±5.54%;组间分化差异具有统计学意义(P<0.05)。结论体外环境下Wnt3a能够促进NSCs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化。

移植时间对大鼠视神经损伤后神经干细胞迁移的影响

目的探讨移植时间对大鼠视神经损伤后神经干细胞(NSCs)在视网膜内迁移的影响。方法 18只SD大鼠行右侧视神经损伤后按随机数字表法随机平均分为3组,并分别于损伤后当天及伤后7d和14d采用微量注射法行右眼视网膜下腔移植2μl(105个/μl)转染绿色荧光蛋白基因的NSCs(GFP-NSCs)。4周后处死大鼠,取右眼球做冰冻切片,对迁移到视网膜内的移植细胞进行计数。各组切片分别用胸腺细胞表面糖蛋白、胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白、视紫红质抗体进行免疫标记,观察各组移植细胞在视网膜上的分化情况。结果损伤当天及伤后7和14d移植组视网膜上的GFP阳性细胞数分别为(163441.14±16876.81)个、(145736.57±27449.07)个和(117291.33±15849.19)个,两两相较,均差异显著(P<0.01)。三组的移植细胞均可在宿主视网膜内存活、迁移,且可分化为神经胶质细胞、神经元和视网膜神经节样细胞。结论大鼠视神经损伤后随着移植时间的推迟,迁移到宿主视网膜内的移植细胞量下降。

Porf-2基因过表达慢病毒载体的构建以及神经细胞的转染

目的构建视前区调控因子2(Porf-2)与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的慢病毒载体,包装慢病毒并体外感染神经细胞。方法根据Gen Bank中基因信息,设计Porf-2的引物,采用PCR扩增Porf-2基因片段;运用基因重组技术,双酶切Porf-2,并将其克隆至p LVX-IRES-Zs Green1载体,经酶切、测序加以鉴定重组质粒。将成功构建的质粒与包装系统VSVG、Δ89质粒共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。结果经酶切和测序鉴定表明成功构建了p LVX-Porf-2-IRES-Zs Green1的基因重组慢病毒载体;将成功包装的病毒感染NG108细胞、海马原代神经元以及神经干细胞后,可观察到大量绿色荧光表达;Western blotting证实Porf-2成功过表达。结论成功构建Porf-2与GFP基因共表达的慢病毒载体、包装慢病毒,并感染NG108、海马原代神经元以及神经干细胞。

神经干细胞增殖和分化相关信号通路的研究进展

神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）是一类来源于中枢神经系统的干细胞，具有自我更新能力及分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，为中枢神经系统损伤和退行性疾病的治疗提供了新的治疗选择。但如何让NSCs在复杂的信号网络调控中实现有序的增殖、分化，修复受损的神经组织，目前研究还未完全清楚。本文对涉及NSCs增殖和分化相关信号通路的最新进展做一综述。

mTOR与中枢神经系统轴索再生

成人中枢神经系统（central nervous system,CNS）损伤后常导致永久性的功能障碍,其中一个重要原因是受损的轴索无法有效再生。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）属于磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3 kinase,PI3K）家族,是PI3K/蛋白激酶B（proteinkinase B,PKB;Akt）信号通路下游的效应蛋白,其底物主要控制与细胞生长及增殖相关的蛋白质合成.

额叶神经节胶质细胞瘤1例

1病例资料患者,男,48岁,因头痛5 d入院。入院时体格检查：神志清楚,GCS评分15分;两侧瞳孔等大、等圆,直径3 mm,对光反射灵敏;四肢肌力Ⅴ级,肌张力正常,两侧巴氏征阴性。颅脑MRI检查示：右侧额叶囊样信号影,呈T1WI低信号、T2WI高信号、Flair稍低信号,病灶大小约5.2 cm×4.8 cm×4.4 cm,边界清楚,病变外上缘可见小片T1WI稍低、

创伤性脑疝后双侧枕叶脑梗死伴Anton综合征一例报道

文章报道1例创伤性脑疝后双侧枕叶脑梗死伴Anton综合征病例。术后早期因患者无视物障碍主诉而未予视觉功能情况检查,术后3周余查体发现眼球固定、双眼上视,颅脑CT及MRI确诊为双侧枕叶脑梗死。予脱水、营养神经及高压氧等治疗,效果欠佳。文章结合文献,对该病例的相关问题进行探讨。

小型猪脑外伤急性颅内高压并失血性休克模型的建立

目的建立小型猪脑外伤急性颅内高压并失血性休克模型,模拟多发伤失血性休克合并脑外伤急性硬膜外血肿,分析其形态学改变。方法对16只实验用小型猪,采用简易脑皮层气击装置致伤一侧脑额叶,硬膜外球囊法致急性颅内高压,改良Wigger氏休克模型法致失血性休克。观察模型制备前(T01)及放血完成后即刻(T0)、15min(T15)、30min(T30)、60min(T60)五个时间点的平均动脉压(MAP)、颅内压(ICP)和脑灌注压(CPP);于T01和T60两个时间点测颈静脉血氧饱和度(SjvO2)。随机选取2只动物,于模型制备前和制备后6h分别行头颅冠状位CT和MRI检查。模型制备后6h,随机选取2只动物分别行脑大体病理、HE染色观察和超微结构观察。结果与T01时间点比较,T0时间点MAP和CPP明显下降,ICP明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与T0时间点比较,T15、T30和T60时间点的MAP、ICP和CCP无明显变化(P>0.05)。T60时间点SjvO2较T01时间点明显下降(P<0.05)。影像学检查发现,创伤性硬膜下出血,中线偏移,对侧脑室扩张。HE染色观察发现,创伤灶及周围脑组织水肿明显,炎症细胞浸润,毛细血管周隙出血,白质区淤点性出血以及灰质挫裂伤。超微结构观察显示,创伤灶、周围和对侧脑组织表现为严重程度递减的改变,包括神经元坏死、变性,轴索脱髓鞘,线粒体肿胀,内皮细胞水肿等形态改变。结论采用控制性脑皮层冲击、硬膜外球囊及股动脉放血方法建立的小型猪脑外伤急性颅内高压并失血性休克组合模型,可模拟临床多发伤失血性休克并脑外伤急性硬膜外血肿,并能用于CPP和脑氧供需平衡的监测。

弥漫性轴索损伤预后影响因素的Logistic回归分析

目的探讨影响弥漫性轴索损伤（DAI）患者长期预后的相关因素。方法采用定群病例的前瞻性研究,记录75例DAI患者的相关指标及伤后6个月随访结果,对其临床和影像相关指标与预后进行单因素和多因素分析,多因素分析采用Logistic逐步回归分析。结果 Logistic逐步回归分析显示入院格拉斯哥昏迷评分（GCS）（OR=0.021,95%CI0.0071.557）、双侧瞳孔变化（OR=27.532,95%CI8.97557.413）、MR I弥散加权成像脑中轴部位病灶数（OR=5.753,95%CI2.1369.392）及脑中轴部位平均表观弥散系数（OR=0.353,95%CI0.1340.964）是影响DAI患者预后的相关因素;上述相关因素结合后预测DAI患者预后的准确率达92.0%。结论入院GCS、双侧瞳孔变化、MR I弥散加权成像脑中轴部位病灶数及脑中轴部位平均表观弥散系数是影响DAI患者预后的独立相关因素;临床因素与影像学指标结合则能更准确地评估DAI患者预后。

对冲性额叶挫裂伤的临床诊治特点

目的探讨对冲性额叶挫裂伤的临床诊治特点。方法对71例对冲性额叶挫裂伤患者进行回顾性分析,着重分析临床过程、影像学特点、手术指征及手术方法的选择。结果非手术治疗的患者27例,GOS评分Ⅴ级20例,Ⅳ级3例,Ⅰ级4例;手术治疗的患者44例,GOS评分Ⅴ级17例,Ⅳ级8例,Ⅲ级5例,Ⅱ级5例,Ⅰ级9例。结论对冲性额叶挫裂伤的病理生理过程较为特殊,对于该类患者应密切观察其意识、瞳孔和生命体征的改变,动态观察颅脑CT变化,CT显示进行性脑水肿扩大和出现第三脑室、基底池受压消失的患者应积极手术,防止中央型脑疝的形成。

高压氧治疗对大鼠脑挫裂伤后认知功能和细胞凋亡的影响

目的:探讨高压氧对脑挫裂伤的治疗作用与对细胞凋亡影响之间的关系。方法:实验于2001-03/2002-05在上海交通大学医学院附属第三人民医院神经外科实验室进行。选择SD雄性大鼠109只,随机分为假手术组、高压氧治疗组和脑损伤组,使用Morris水迷宫实验测试大鼠伤前及伤后的认知功能;分别应用透射电镜、原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞技术对各组动物挫伤灶旁和海马结构的细胞凋亡情况进行检测。结果:各组大鼠全部进入结果分析,无脱落。①Morris水迷宫实验结果:脑外伤后大鼠逃生时间显著延长(P<0.01),而高压氧治疗使逃生时间明显缩短(P<0.05);②各组动物挫伤灶旁和海马结构的细胞凋亡情况:假手术组无细胞凋亡,损伤组和治疗组存在细胞凋亡,细胞凋亡的发生在伤后24h达到高峰,高压氧治疗组在伤后24h和48h细胞凋亡发生率显著低于相应的损伤对照组(P<0.05)。结论:脑挫裂伤后大鼠的认知功能显著减退,高压氧可以显著改善脑外伤后下降的神经功能;高压氧治疗对脑挫裂伤后细胞凋亡的发生有显著影响,抑制细胞凋亡很可能是高压氧对脑挫裂伤治疗作用的重要机制。

弥散张量成像对弥漫性轴索损伤的定量研究

目的:探讨磁共振弥散张量成像(DTI)各向异性分数(FA)对弥漫性轴索损伤(DAI)患者伤情判断及预后评估的价值。方法:DAI患者28例为DAI组,健康志愿者10例为对照组;入院时格拉斯哥昏迷量表(GCS)评价昏迷程度,伤后2周内行MR检查,得到DTI序列影像资料,伤后6个月采用格拉斯哥预后量表(GOS)评估预后;测量感兴趣区(ROI)FA值,比较2组之间FA值、DAI组患侧可视性病灶和健侧对称部位的FA值,并分析DAI组病灶区FA均值与GCS、GOS评分的相关性。结果:DAI组各ROI区FA值显著低于对照组(P<0.01),DAI组各部位可视性病灶区FA值较健侧对称处显著降低(P<0.01),脑干部位(中脑、脑桥及延髓)FA值与GCS、GOS评分正相关(P<0.01),胼胝体FA值与GCS评分正相关(P<0.01)。结论:DTI为诊断DAI病灶的敏感序列,其ROI区FA值变化有助于DAI患者伤情判断及预后评估。

影像学技术在创伤性脑损伤预后评估中的应用及进展

创伤性脑损伤（traumaticbraininjury．TBI）是医疗卫生领域严重的世界性问题。根据流行病学调查显示，美国每年大约170万人罹惠TBI，其中约有27．5万人接受住院治疗．5-2万人死亡，12．4万人遗留长期损伤或者永久残疾。对于TBI的预后评估是神经外科多年来一直探讨的热点问题。影像学在临床上对TBI预后的评估有着重要作用。本文就近年来一些较新的影像学技术在TBI预后评估中的应用进行综述如下。

弥漫性轴索损伤46例诊治分析

目的探讨弥漫性轴索损伤(DAI)患者的临床特点、早期诊断、治疗方法和预后。方法对2003年12月至2008年3月收治的46例DAI患者进行回顾性研究,着重分析其临床特点、影像学资料、治疗及预后。结果46例DAI患者中,6例恢复良好,14例中残,13例重残,2例植物生存,11例死亡。结论DAI原因多为车祸伤及高空坠落伤,早期确诊缺乏有力的影像学证据,治疗效果欠佳。联合应用CT和多种MRI序列有利于早期诊断,采用综合治疗方案是降低患者死亡率和致残率的关键。

大鼠弥漫性轴索损伤后脑干内α7烟碱型乙酰胆碱受体的表达变化

目的探讨弥漫性轴索损伤(DAI)后大鼠脑干内的烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAChR)的动态变化。方法 50只SD大鼠按随机数字表随机分为正常组、假损伤组、DAI7d组、DAI30d组和DAI90d组,每组10只。正常组立刻处死,假损伤组麻醉且固定于头夹后处死,DAI7d组、DAI30d组与DAI90d组分别于致伤后7、30与90d后处死。取脑干进行免疫组化染色,检测α7nAChR的表达情况,使用IPP软件对α7nAChR进行定量评估。结果正常组、假损伤组与DAI7d组之间α7nAChR的表达无显著性差异。DAI30d组与正常组、假损伤组、DAI7d组相比,α7nAChR表达水平明显降低(P<0.05);而DAI90d组α7nAChR表达水平又明显低于DAI30d组(P<0.05)。结论 DAI可引起大鼠脑干组织中α7nAChR表达的减少。