应用于整形外科领域的组织工程化软骨

软骨组织工程的基本技术路线是在体外培养种子细胞．并以一定浓度将其种植于具有良好生物相容性和可降解性的合适支架上。形成细胞一支架复合物．将此复合物植入生物体内组织缺损部位。最终完成对组织的修复和再造。软骨组织工程的应用目前主要集中在两个领域：骨科和整形外科。整形外科软骨组织工程的研究方向与骨科有所不同：就临床常用作修复或填充的器官类型（耳廓、气管、鼻翼、鼻假体、颏假体等）而言，它们属于非承重结构，因而对其在软骨力学方面的要求相对较低。然而，整形外科对于修复体形态的要求则更高、更精确。所以，如何使所预制的支架材料在形成软骨的过程中始终保持其复杂的表面形状是一个更大的挑战。以下就构建适用于整形外科领域的组织工程化软骨的可选择方案做一综述。

个性化外鼻形态组织工程支架材料的制作

目的探索应用计算机辅助设计与快速成型技术制作个性化精确外鼻形状组织工程支架材料的可行性。方法通过计算机辅助设计技术,对患者头颅CT数据进行三维重建,并对外鼻进行分割,得到外鼻的三维重建模型,并建立外鼻模型数据库。利用快速成型技术,打印出两块与外鼻模型对应的树脂阴模。将非编织聚羟基乙酸(PGA)置入树脂阴模内压制成型,再通过聚乳酸(PLA)包埋,提高支架的强度,最终制作出个性化外鼻形态PGA-PLA支架。结果该外鼻形状支架具有精确的三维立体结构,符合组织工程化外鼻支架材料制作的形态需求。结论应用计算机辅助设计与快速成型技术,能精确制作个性化组织工程外鼻形状支架材料。

构建组织工程化耳廓软骨修复体

因先天性小耳畸形、外伤、肿瘤造成的外耳缺损或缺失在临床中较为常见。目前治疗的手段主要是采用切取的自体肋软骨，并对其雕刻成型重建患耳。但其不同程度的存在耳廓造型不一，供区继发缺损等问题。组织工程技术嘲的出现无疑为无（微）创修残补缺提供了可能。目前的软骨组织工程技术主要是利用自体软骨细胞或成体干细胞作为种子细胞，接种在具有三维多孔结构的可降解支架上，通过特定的培养构建方法，最终形成软骨组织以修复缺损。

“耳郭软骨组织工程的研究进展”点评

先天性小耳畸形是较为常见的新生儿出生缺陷,目前临床治疗以自体肋软骨耳郭再造移植或人工支架植入为主,但这些治疗手段均具有一定局限性。软骨组织工程技术可实现自体细胞的耳郭结构修复及功能重建,为小耳畸形的治疗提供了新方法。尽管软骨组织工程技术获得了较大发展,但仍有诸多关键科学问题尚未阐明,一些关键技术仍需优化。该文就目前组织工程耳郭软骨的研究进展及一些关键技术瓶颈作了详细的综述,并提出了后续的研究方向。

反应器内构建组织工程血管平滑肌层的实验研究

目的探讨生物反应器内构建组织工程血管的可行性。方法于6个月龄犬颈总动脉血管获取平滑肌细胞，经体外培养扩增后接种于聚羟基乙酸（PGA）上，形成细胞一材料复合物，并将其置于生物反应器内培养。实验组模拟成年哺乳动物循环系统的参数予以动态力学刺激培养（搏动频率：75次，分；扩张量〈5％）；对照组为静态培养，其余与实验组相同，分别于3与6周后取材检测。结果生物反应器内培养的血管大体观察具有良好的弹性，管腔圆，色泽光亮；HE染色显示平滑肌纤维成分排列较规则，有层次感；弹力纤维染色显示弹力纤维成分较多而密；免疫组织化学检测显示为棕黄色层状排列的平滑肌纤维。对照组弹性欠佳，管腔塌陷，色泽暗淡；平滑肌纤维与弹力纤维成分较少且排列紊乱，层次感差。结论应用生物反应器可构建具有良好结构的血管样结构的平滑肌层组织。

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数。方法抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2代BMSCs,以5.0×107/cm3的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养。8周后取材,行相关检测。结果力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分。GAG含量为(6.0±1.2)mg/g,抗压强度为(2.2±0.8)kPa,弹性模量为(7.4±1.6)kPa。各项指标均明显优于其他各组。结论力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。

组织工程的突破与挑战——组织工程国家工程中心科研进展

组织工程技术已被普遍认为是解决组织、器官缺损修复与功能重建的有效手段,它的飞速发展依赖于细胞学、材料学、工程学、临床医学等多学科的交叉渗透.作为组织工程的三大核心,种子细胞、生物材料、组织构建各方面的突破,为组织工程技术的发展奠定了基础.组织工程国家工程中心近年来围绕上述核心开展了系列研究,通过研究胚胎干细胞、成体干细胞、同种异体干细胞、以及发育同源细胞替代的探索,为解决种子细胞来源问题提供了多种选择;生物支架材料的开发,为细胞增殖分化、组织再生提供理想的支持与空间,而生物反应器的开发与应用,进一步提高了组织构建技术,为促进组织的体外形成、重塑和功能成熟创造了条件.在此基础上,开展了大动物体内组织构建和缺损修复的研究,形成了以应用为目标的研究特色,并成功将部分技术应用于临床治疗.本文将对组织工程国家工程中心已有进展做简单介绍并对面临的挑战进行分析.

组织工程化肌腱种子细胞的研究

组织工程化肌腱有望成为临床肌腱缺损修复最为理想的替代物。随着种子细胞功能研究的逐步深入、新型种子细胞的不断发掘以及相关科学技术的进步,制约组织工程化肌腱发展的瓶颈之一“种子细胞”问题逐渐得到解决,组织工程化肌腱的体外构建及体内应用亦随之日趋成熟。着重就肌腱种子细胞的研究进展作一综述。

小鼠脂肪干细胞分离培养方法

目的建立一种简单高效的小鼠脂肪干细胞分离培养方法,为小鼠模型中间充质干细胞研究提供充足的细胞来源。方法体外分离小鼠腹股沟皮下脂肪组织,应用0.1%胶原酶NB4消化,含10%FBS的低糖DMEM培养基贴壁培养小鼠脂肪干细胞,并对其细胞形态、体外增殖能力、多向分化潜能及表面标记进行分析研究。结果体外分离培养的小鼠脂肪干细胞具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,体外经三向诱导,具有成脂、骨及软骨分化潜能,表面标记CD34、CD105阳性,Sca-1高表达,不表达CD45及SSEA-1。结论利用该实验方法,能培养出高纯度、具有良好干性及极强增殖能力的小鼠脂肪干细胞。

间充质干细胞体外软骨定向诱导条件的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的主要瓶颈。软骨细胞增殖能力有限,体外大量扩增后易发生老化及去分化,丧失软骨形成能力,且软骨细胞的增殖能力随年龄增长逐渐下降进一步限制了其在组织工程中的应用。如何寻找到最佳的种子细胞是目前组织工程研究的热点之一。

同种异体软骨细胞与自体骨髓基质干细胞混合共培养构建软骨皮下移植的可行性研究

背景:软骨组织工程的种子细胞问题是目前研究的热点和难点,如何找到一种既能够避免对自体软骨进行取材又能够达到稳定软骨构建目的的方法呢?本研究尝试利用少量同种异体羊软骨细胞作为软骨诱导微环境提供者,与扩增后的羊自体BMSC混合共培养并植入皮下环境,探讨利用同种异体软骨细胞共培养构建软骨皮下移植的可行性。方法:本实验对山羊软骨细胞和BMSC分别进行取材和分离培养扩增,并将以上细胞分为以下四组进行混合并接种在PGA支架材料上:A组:100%自体软骨细胞;B组:30%自体软骨细胞+70%自体BMSCs;C组:30%同种异体软骨细胞+70%自体BMSCs;D组:100%同种异体软骨细胞。经过体外构建6周后植入羊皮下进行体内构建12周,对所形成的组织块进行大体观察和组织学染色等评价。结果:自体软骨细胞组和自体软骨细胞混合自体BMSC组皮下移植后可见成熟软骨组织形成,但同种异体软骨细胞参与的两组(包括同种异体软骨细胞混合自体BMSC的实验组和单纯异体软骨细胞组)在皮下环境中都因为较强的免疫反应未能形成软骨组织。结论:同种异体软骨细胞以及PGA支架材料的存在对于组织工程软骨在羊皮下环境的构建有负面影响。

血清浓度影响骨髓基质干细胞体外软骨分化的实验研究

目的 探讨含有不同浓度胎牛血清的成软骨分化诱导液对骨髓基质干细胞（BMSCs）体外分化的影响，明确体外培养用血清在细胞分化中的作用，为软骨的体外组织构建提供技术参数。取第2代猪BMSCs，以5×10^7个细胞/cm^3的密度接种到聚羟基乙酸（PGA）制成的圆盘状支架上（直径5mm，厚度2mm），7d后分别应用含0％、5％、10％血清浓度的诱导液（诱导因子包括TGF-1、IGF-Ⅰ及地塞米松）进行体外持续性诱导培养。8周取材行组织湿重测量、GAG含量定量分析、大体观察、组织学、组织化学及免疫组织化学检测。结果 10％血清组复合物外观瓷白色，坚硬细腻，体积和外形均无明显变化。组织学及免疫组织化学检测结果显示有典型的软骨陷窝，大量的软骨特异性细胞外基质成分，组织湿重和GAG定量亦明显高于其它两组；3％血清组复合物体积缩小．有少量陷窝样结构及软骨特异性胞外基质聚集；而无血清组复合物缩小，松软易碎，未见典型的软骨陷窝和软骨特异性基质成分。结论 体外诱导培养BMSCs构建组织工程软骨过程中，10％浓度的血清成分有利于BMSCs成软骨分化。

利用皮肤成纤维细胞重建兔角膜基质组织的初步研究

目的探讨利用皮肤成纤维细胞替代角膜基质细胞，构建兔角膜基质组织的可行性。方法实验研究。通过酶消化的方法分离培养同种异体新生兔皮肤成纤维细胞，用腺病毒转染绿色荧光蛋白（GFP）基因标记细胞，接种细胞于聚羟基乙酸（PGA）圆盘支架，形成细胞．PGA复合物，移植于成年兔角膜基质层。动态观察构建组织在角膜内的变化情况，并于第3、6、8周取材进行大体、组织学、GFP表达及角膜基质特异蛋白Keratocan的检测。透射电镜观察胶原纤维排列并测量其直径。应用t检验统计分析数据。结果术后8周，实验侧角膜逐渐恢复透明，形成的新生角膜基质样组织，排列较规则。荧光显微镜检测显示GFP阳性细胞存在，形成基质板层样组织，同时该部分细胞表达Keratocan。胶原纤维排列规则，实验组胶原纤维直径为（33．08±2．47）nm，经统计学分析，与正常角膜差异无统计学意义（t=1．80，P=0．0771）。结论皮肤成纤维细胞可以替代角膜基质细胞，在兔角膜内构建组织工程角膜基质组织。

三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的分离培养猪不同亚型软骨组织(弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨)来源干细胞并鉴定,为软骨组织工程提供理想种子细胞。方法利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,并进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平(阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45),单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力。三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能。RT-PCR检测成骨(Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原)、成软骨[蛋白聚糖(Aggrecan)、II型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)]相关基因表达,并以猪BMSCs作为对照。结果通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨(弹性软骨)、关节软骨(透明软骨)、椎间盘软骨(纤维软骨)分选出一群细胞,细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45。经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆。三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力。RT-PCR结果显示,成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs(P<0.05),耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义(P>0.05);成软骨诱导后,3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs(P<0.05);成脂诱导后,3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs,但比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征。

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养构建软骨的体内评价

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞（BMSC）共培养体外构建复合物体内植入形成成熟软骨组织的可行性。方法体外培养扩增猪BMSC，经绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染标记后，与猪关节软骨细胞按1：1比例混合，以5．0×10^7／ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）材料支架作为共培养组，以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种PGA／PLA作为阳性对照组及阴性对照组。各组标本均于体外培养2周后植于裸鼠皮下，8周后取材，通过大体观察、激光共聚焦显微镜观察、糖胺聚糖含量测定、生物力学、组织学以及免疫组织化学等方法对新生软骨组织进行全面评价。结果各组细胞均与材料黏附良好。体内植入8周后，共培养组及阳性对照组标本基本保持植入前的大小和形状，外观类似软骨组织，组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成，免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积。定量测定结果显示，共培养组的糖胺聚糖含量和弹性模量均达到软骨细胞构建软骨组织的80％以上。共聚焦显微镜观察可见EGFP标记细胞形成了软骨陷窝。阴性对照组标本的体积较植入前明显缩小，组织学及免疫组织化学均未见软骨样组织形成。结论软骨细胞与BMSC共培养构建的复合物植入体内后能继续形成成熟软骨组织，这表明植入体内后软骨细胞仍能保持对BMSC的诱导作用。

应用CAD与快速成型技术制作个性化耳廓再造支架

我们拟将CAD、快速成型技术与组织工程支架材料制备技术相结合，建立制作个性化精确耳廓形态组织工程支架材料的技术平台，为利用组织工程技术构建特定形状的软骨组织奠定技术基础。

重组hTGF-β1基因转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究

目的重组hTGF-β1腺病毒(adeno-hTGF-β1)转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究,探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1转染猪BMSCs,酶联免疫吸附定量检测(ELISA法)重组腺病毒转染hTGF-β1蛋白的表达。然后消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs,均匀接种于圆盘状PGA支架上,对照组转染adeno-LacZ,然后植入裸鼠背部皮下,在植入后第3周取材,分别行大体观察、组织学、II型胶原免疫组化和蛋白聚糖含量检测对形成组织进行评价。结果 ELISA结果显示adeno-hTGF-β1转染的BMSCs,其hTGF-β1表达量是转染adeno-lacZ 的BMSCs 2.65倍( P<0.05)。植入裸鼠体内后3周取材,实验组HE染色观察可见有软骨形成,但较不均匀,并被纤维组织分割,形成的软骨组织区域可见软骨细胞包埋在软骨陷窝内;对照组可见仅有少量软骨形成,被大量的纤维组织和未降解的PGA支架包裹,实验组和对照组形成软骨占总组织百分比,分别为(41.83±4.64)%和(17.50±2.85)%,P<0.05。Safranin’O染色显示,实验组形成的软骨组织区域都有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,着色比对照组更深。实验组形成的软骨组织区域有大量棕黄色的II型胶原颗粒,而对照组仅有少量的棕黄色的II型胶原颗粒,实验组形成的软骨组织中的蛋白聚糖含量多于正常猪耳软骨。结论重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs作为种子细胞,在裸鼠体内能促使软骨组织形成,从而为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础。