载重组人釉原蛋白水凝胶缓释系统对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响

目的·探讨载重组人釉原蛋白(recombinant human amelogenin,rhAm)水凝胶缓释系统对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts, HPDLFs)增殖、迁移、黏附及成骨、成牙骨质分化能力的影响。方法·组织块法获取原代HPDLFs,传代培养后将第3～5代细胞分为对照组、蛋白组(20μg/mL rhAm)、载蛋白水凝胶组(含20μg/mL rhAm的PCLA-PEG-PCLA水凝胶)。以CCK-8法检测细胞增殖与生长曲线的变化,采用划痕实验及Transwell小室实验检测细胞迁移的效果,以细胞计数法及扫描电子显微镜(电镜)观察并检测细胞黏附的效果,采用实时荧光定量PCR技术测定ALP、Runx2、CEMP1和CAP mRNA的表达,观察成骨能力的改变。结果·载rhAm水凝胶缓释系统对HPDLFs的生长曲线没有显著影响,对其增殖有促进作用,第3日时差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验和Transwell小室实验中,蛋白组迁移最快,其次为载蛋白水凝胶组。载蛋白水凝胶对HPDLFs的黏附有促进作用,4 h时差异有统计学意义(P<0.05),扫描电镜下蛋白组与载蛋白水凝胶组的细胞伸展状态较好。HPDLFs经载蛋白水凝胶诱导培养后,ALP、Runx2、CEMP1、CAP mRNA表达在不同时间点有所上调。结论·载rhAm水凝胶缓释系统可显著促进HPDLFs的增殖和黏附,对其迁移无显著影响,对其成骨及成牙骨质能力均有显著促进作用。

抗人釉原蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备针对人釉原蛋白的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。方法:用原核表达系统表达纯化的重组人全长釉原蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,采用有限稀释法和间接酶联免疫吸附测定法筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠体内诱导制备腹水,通过饱和硫酸铵沉淀法和蛋白G亲和层析柱纯化抗体。结果:筛选到3株能稳定分泌抗人釉原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为H10G1、H3G1、G5H3。腹水单克隆抗体效价分别为1∶243 000、1∶729 000、1∶729 000,纯化后单克隆抗体效价为1∶81 000、1∶243 000、1∶729 000。3株单克隆抗体抗原表位分析显示均识别人釉原蛋白45～149位的氨基酸序列。结论:成功制备出针对人釉原蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究探讨釉原蛋白在牙根发育及牙周再生中的功能奠定了基础。

外源性ATP对牙龈成纤维细胞NLRP3炎症小体活化的影响

目的 :观察外源性三磷酸腺苷(ATP)对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)和热灭活牙龈卟啉单胞菌(HP.gingivalis)感染的人牙龈成纤维细胞NLRP3炎症小体(inflammasome)的活化以及下游因子IL-1β分泌的影响。方法:组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞(h GFs)获取原代细胞,经5 mmol/L ATP预处理,用100 MOI P.gingivalis、100 MOI HP.gingivalis体外刺激h GFs,实时定量PCR检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的基因表达;Western免疫印迹技术检测细胞内NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达;ELISA法检测白细胞介素1β(IL-1β)的分泌。采用Graphpad prism 6软件包对数据进行t检验或单因素方差分析。结果 :与对照组相比,P.gingivalis下调NLRP3、ASC mRNA,上调IL-1β基因表达,下调NLRP3、IL-1β胞内蛋白水平。HP.gingivalis诱导NLRP3、IL-1β、ASC基因和胞内蛋白的表达,P.gingivalis或者HP.gingivalis单独刺激对Caspase-1 mRNA水平及IL-1β分泌均无影响。ATP/P.gingivalis或ATP/HP.gingivalis共刺激均明显上调NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β基因及胞内蛋白水平,增加上清液中IL-1β的分泌水平。结论:外源性ATP可调控牙周主要致病菌P.gingivalis感染的人牙龈成纤维细胞NLRP3炎症小体的激活,介导炎症因子IL-1β的成熟与分泌。