烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性与基因组信息和对细菌生物膜的作用

目的分离可裂解烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体,研究其生物学特性、基因组信息及对细菌生物膜的作用。方法(1)2018年,取分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院(下称瑞金医院)烧伤患者血液的泛耐药肺炎克雷伯菌UA168(下称宿主菌)液,采用污水共培养法及滴板法和双层琼脂平板法,从瑞金医院污水中分离纯化得到烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体,将其命名为噬菌体KP168,观察其噬菌斑形态。(2)取噬菌体KP168液行氯化铯密度梯度离心和透析后,采用磷钨酸负染法通过透射电子显微镜观察噬菌体KP168形态。(3)取噬菌体KP168液,采用滴板法检测其对从瑞金医院烧伤患者血液中分离得到的20株泛耐药肺炎克雷伯菌的裂解能力,计算裂解率。(4)分别以感染复数为10.000、1.000、0.100、0.010和0.001共同常规振荡培养初始效价为9.3×10^11噬菌斑形成单位(PFU)/mL噬菌体KP168液(每管400μL)和浓度为1×10^9集落形成单位(CFU)/mL宿主菌液(每管4 mL)4 h(每种感染复数1管),采用双层琼脂平板法测算噬菌体KP168效价(测算方法下同)以筛选最佳感染复数,实验重复3次。(5)以感染复数为0.005混合浓度为1×10^9 CFU/mL宿主菌液(每管4 mL)和效价调整为5×10^7 PFU/mL噬菌体KP168液(每管400μL),分别于混合后0(即刻)、1、2、3、4、5、15、30 min(每个时间点1管)采用双层琼脂平板法计数噬菌斑(计数方法下同),计算已吸附噬菌体百分比以筛选最佳吸附时间,实验重复3次。(6)以感染复数为0.005混合浓度为1×10^9 CFU/mL宿主菌液(每管300μL)和效价调整为5×10^8 PFU/mL噬菌体KP168液(每管60μL),静置最佳吸附时间后常规振荡培养,分别于培养0(即刻)、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min测算噬菌体KP168效价,绘制一步生长曲线,实验重复3次。(7)取效价为2.5×10^10 PFU/mL噬菌体KP168液,分别于37、40、50、60、70℃静置培养1 h(每个时间点3管,每管1 mL),计数噬菌斑并绘制热稳定曲线。取效价为3.0×10^10 PFU/mL噬菌体KP168液,分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0的SM缓冲液于37℃静置培养1 h(每种pH值3管,每管含100μL噬菌体KP168液、900μL SM缓冲液),计数噬菌斑并绘制酸碱稳定曲线。(8)取噬菌体KP168液同实验(2)透析后行DNA抽提与测序,用Prokka对全基因组进行注释以获得噬菌体KP168编码序列,使用Nucleotide BLAST功能进行核酸序列比对以寻找与噬菌体KP168核酸序列相似度最高的已知噬菌体,使用Blastx功能将编码序列翻译成蛋白质后进行功能预测,比对抗性基因数据库和毒力因子数据库。(9)于96孔板中,分别以感染复数为1.000、0.100、0.010和0.001,在浓度为1.5×10^8 CFU/mL(浓度下同)的200μL宿主菌液中加入初始效价为5.8×10^10 PFU/mL噬菌体KP168液20μL(每种感染复数3孔)共同培养48 h;将200μL宿主菌液静置培养48 h后,分别加入效价为1×106、1×10^7、1×10^8、1×10^9、1×10^10 PFU/mL的噬菌体KP168液20μL(每种效价3孔)静置作用4 h。2种实验均以200μL宿主菌液中加入SM缓冲液20μL(3孔)为阴性对照,以220μL LB培养液(3孔)为空白对照,均采用酶标仪测定吸光度值并分别计算生物膜抑制率和生物膜破坏率,实验均重复3次。结果(1)成功分离纯化噬菌体KP168,其噬菌斑透亮,呈圆形,直径约1.5 mm。(2)噬菌体KP168呈正多面体结构,直径约为50 nm,无尾部结构。(3)噬菌体KP168可裂解20株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌中的13株,裂解率为65.0%。(4)感染复数为1.000时,噬菌体KP168与宿主菌共同培养4 h后,效价最高,以此为最佳感染复数。(5)噬菌体KP168与宿主菌混合后4 min,已吸附噬菌体百分比最高,以此为最佳吸附时间。(6)一步生长曲线表明噬菌体KP168裂解宿主菌时,潜伏期约10 min,裂解期约40 min。(7)噬菌体KP168在40℃、pH值为7.4时,噬菌斑数最多,活性最大。(8)噬菌体KP168基因组是线状双链DNA,长度为40114 bp;有48个可能编码序列;与Klebsiella phage_vB_Kp1相似度最高;编码序列翻译蛋白对应的已知最相似蛋白中包含23个假设蛋白和25个已知功能蛋白;未见抗性基因和毒力因子基因;获得GeneBank登录号MN585130。(9)以各感染复数共同培养噬菌体KP168与宿主菌48 h后,生物膜抑制率相近,平均约为45%;效价为1×10^9 PFU/mL噬菌体KP168作用于宿主菌已形成的生物膜4 h后,生物膜破坏率最高,达平均42%。结论本研究自污水中分离得到1株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体——噬菌体KP168,该株噬菌体属于无尾科噬菌体,宿主谱宽、吸附时间短、潜伏期短,具有一定的热和酸碱稳定性;其基因组信息明确,不含抗性基因及毒力因子基因;对细菌生物膜的形成有抑制作用,对已形成的细菌生物膜有破坏作用。