OX40/FcγR多基因人源化小鼠模型的构建及在激动型OX40抗体研究中应用的验证

目的·建立一种能够快速获得可用于激动型抗体活性评估的OX40/FcγR[肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tumor necrosis factor receptor superfamily member 4,OX40)/Fcγ受体(Fcγreceptor,FcγR)]多基因人源化小鼠模型的方法。方法·将表达人源OX40分子的小鼠骨髓细胞与表达人源FcγR的小鼠骨髓细胞等比例混合后,通过尾静脉注射到经过辐照的野生型小鼠体内,构建骨髓嵌合小鼠。通过流式细胞术检测骨髓嵌合小鼠中OX40/FcγR人源分子的表达情况,确认免疫系统的重建效率。对构建成功的骨髓嵌合小鼠,使用流式细胞术评估人类抗人OX40单克隆抗体对CD4+、CD8+T细胞的免疫激活活性。2组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果·流式细胞术的结果显示,骨髓嵌合小鼠脾脏、外周血和淋巴结中的B淋巴细胞、髓系细胞均可以表达高水平的人源FcγR分子(均P<0.05);骨髓嵌合小鼠T淋巴细胞在体外激活后有明显的人源OX40分子的表达(P<0.05)。使用人类激动型抗人OX40抗体对骨髓嵌合小鼠进行处理显示,人类激动型抗人OX40抗体可以明显增强小鼠体内T细胞的γ-干扰素(interferonγ,IFN-γ)表达量,和CD4+T细胞上OX40分子的表达(均P<0.05)。结论·以表达人源OX40分子的小鼠与表达人源FcγR的小鼠的骨髓细胞为基础构建的骨髓嵌合小鼠模型能够同时表达人源OX40和FcγR分子,可用于评估人类激动型抗人OX40抗体的体内活性。

轻链单个氨基酸改变可增强新冠病毒嵌合抗体的中和能力

目的·筛选对新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)具有中和能力的人鼠嵌合抗体,并分析其轻链上的关键氨基酸位点变化。方法·以SARS-CoV-2刺突蛋白作为免疫原,免疫抗体重链基因人源化的小鼠,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和假病毒中和实验检测小鼠血清抗体水平,应用流式细胞术分选小鼠脾脏和淋巴结中的浆细胞和生发中心(germinal center,GC)B细胞并分析各类B细胞比例。提取细胞的RNA构建鼠源抗体轻链基因文库,与固定的人源抗体重链基因配对表达抗体,并采用ELISA筛选高亲和力嵌合抗体。与鼠源胚系抗体轻链基因比对,分析高亲和力嵌合抗体轻链的氨基酸变化位点。分别构建并表达轻链单个氨基酸位点改变的嵌合抗体,通过ELISA和假病毒中和实验检测其亲和力及中和能力;比较上述位点改变前后嵌合抗体的亲和力及中和能力,并分析具有关键作用的氨基酸位点变化。结果·与未免疫小鼠相比,免疫后小鼠血清中针对SARS-CoV-2的特异性抗体的滴度增加,脾脏和淋巴结中的浆细胞和GC B细胞的比例亦有增加。ELISA的结果显示,从小鼠脾脏的GC B细胞中筛选到具有高亲和力的嵌合抗体。该抗体轻链的第76位苏氨酸替换成了异亮氨酸,且第98位苯丙氨酸发生缺失。随后,ELISA结果显示,该嵌合抗体具有较强的亲和力,轻链氨基酸没有变化的抗体和轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的亲和力较弱,而轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的亲和力介于嵌合抗体和轻链氨基酸没有变化的抗体之间。假病毒中和实验的结果显示,该嵌合抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为0.995 ng/μL;轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的IC_(50)为1.724 ng/μL,中和能力有所减弱;轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的IC_(50)为71.05 ng/μL,轻链氨基酸没有变化的抗体的IC_(50)为42.06 ng/μL,中和能力均较弱。结论·成功筛选得到对SARS-CoV-2具有中和能力的人鼠嵌合抗体,且该抗体轻链上第76位苏氨酸替换为异亮氨酸是决定其中和能力的关键。

大鼠骨髓间充质干细胞与Sertoli细胞体外共培育的免疫负调作用

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)与Sertoli细胞(SCs)体外共培育时对免疫应答的调节作用,为两者联合应用于移植修复提供线索。方法用密度梯度离心法分离SD大鼠脾脏单个核细胞(简称L),羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞后,将其加入按照不同的比例混合的BMSCs与SCs共培育体系,设立L细胞为对照组,L+刀豆蛋白A(ConA)、BMSCs+L+ConA、SCs+L+ConA、BMSCs+SCs+L+ConA四大组细胞为实验组。培养4 d,通过流式细胞术分析T淋巴细胞的增殖情况。结果单个核细胞培养体系中加入ConA可以显著刺激T淋巴细胞增殖。BMSCs、SCs均可抑制淋巴细胞增殖,抑制作用随加入BMSCs和SCs的比例增加而增强,BMSCs和SCs混合培养后对淋巴细胞增殖抑制作用进一步增强,且在某些浓度时呈现协同性。结论 BMSCs与SCs体外共培育时可增强免疫抑制作用。

哺乳动物细胞表面展示IgG抗体Fc组合突变库的构建及评估

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233~240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况。结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58%的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6%,3T3细胞的感染效率为47.4%;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92%的组合突变(9898/11520)。结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85%的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库。

Galectin-9阳性肿瘤相关巨噬细胞在肌层浸润性膀胱癌中的表型、功能及临床治疗意义

目的·分析半乳糖凝集素9阳性肿瘤相关巨噬细胞(galectin-9^(+)tumor-associated macrophages,galectin-9^(+)TAMs)在肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)组织中的表型特征,探究MIBC微环境对galectin-9^(+)TAMs的调控作用,galectin-9^(+)TAMs抑制CD8^(+)T细胞反应的机制及其临床治疗意义。方法·通过流式细胞术检测MIBC与癌旁组织中galectin-9^(+)TAMs的表型特征。利用TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库筛选与LGALS9和LGALS9巨噬细胞基因集显著相关的细胞因子。用人重组细胞因子体外刺激巨噬细胞,分为人重组巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human macrophage-stimulating factor,rh M-CSF)刺激组、人重组白介素-16 (recombinant human interleukin-16,rh IL-16)刺激组和人重组干扰素γ (recombinant human interferon-γ,rh IFN-γ)刺激组,并通过流式细胞术检测3组galectin-9表达情况。流式细胞术检测加入rh M-CSF中和性抗体后巨噬细胞表达galectin-9的情况。Anti-galectin-9抗体处理MIBC单细胞悬液后,通过流式细胞术检测TAMs的效应功能变化。分选癌与癌旁组织中galectin-9^(+)TAMs和人外周血CD8^(+)T细胞并进行体外共培养,通过流式细胞术检测CD8^(+)T细胞效应功能变化。采用anti-galectin-9抗体和程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1,PD-1)抗体单独及协同处理体外培养的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡及CD8^(+)T细胞效应功能变化。结果·Galectin-9^(+)TAMs高表达人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)、CD86、CD206和细胞程序性死亡-配体1 (programmed cell death-ligand 1,PD-L1),分泌IL-10和转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)增加,分泌肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)减少。TCGA数据库筛选结果显示,M-CSF、IL-16和IFN-γ与LGALS9和LGALS9巨噬细胞基因集的相关性最显著。用rh M-CSF、rh IL-16和rh IFN-γ体外刺激巨噬细胞,rh M-CSF刺激组中galectin-9的表达显著升高,加入中和性抗体后表达显著下调。阻断galectin-9后,TAMs表型从高表达抑制性分子向促炎症分子转换,其表面表达PD-L1显著下降。体外共培养galectin-9^(+)TAMs和CD8^(+)T细胞后,galectin-9^(+)TAMs能够抑制CD8^(+)T细胞的效应功能,该作用部分依赖于galectin-9。联合阻断galectin-9和PD-1后,肿瘤细胞凋亡比例、CD8^(+)T细胞的增殖能力和效应分子的分泌与单独阻断PD-1相比,均显著增多或增强。结论·Galectin-9^(+)TAMs具有免疫抑制表型和功能。肿瘤来源M-CSF诱导TAMs高表达galectin-9。Galectin-9^(+)TAMs抑制CD8^(+)T细胞功能从而促进MIBC免疫逃逸。联合阻断galectin-9和PD-1能够更有效地重激活CD8^(+)T细胞功能。

抗体基因点突变、插入和缺失体外检测方法的建立及应用

目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)引起的体细胞高频突变过程中,快速检测抗体基因可变(variable,V)、多样(diversity,D)、连接(joining,J)区发生突变(包括点突变、插入和缺失事件)的体外方法。应用该方法检测经2种DNA聚合酶β(polymeraseβ,Polβ)抑制剂处理的细胞中抗体基因VDJ片段的突变情况。方法·用慢病毒感染法处理CH12F3细胞(即处理组),感染前的CH12F3细胞为对照组。采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测2组细胞中AID的表达水平。构建高通量测序文库,应用生物信息学的方法分析处理组和对照组细胞中抗体基因VDJ片段的点突变、插入及缺失频率。采用不同浓度的Polβ抑制剂[扎西他滨(2’,3’-dideoxycytidine,DDC)、5-甲氧基黄铜(5-methoxyflavone,5-MF)]处理CH12F3细胞,并采用台盼蓝拒染法测定该2种抑制剂对细胞增殖的影响。分别以筛选得到的DDC浓度、5-MF浓度处理CH12F3细胞(即实验组),以0.9%NaCl处理的细胞及DMSO处理的细胞依次记为上述实验组的对照组,使用上述已建立的方法进行处理,最终行高通量测序,分析该2种抑制剂对抗体基因VDJ片段中点突变、插入及缺失频率的影响。结果·Western blotting结果显示,和CH12F3细胞对照组相比,CH12F3细胞处理组中AID表达较高;且高通量测序结果显示,该组在抗体基因VDJ片段上存在大量的点突变,且插入和缺失的频率均较高(均P=0.000)。台盼蓝拒染法检测显示,处理CH12F3细胞最适宜的DDC浓度为100μmol/L、5-MF浓度为25μmol/L。最终的高通量测序结果显示,和0.9%NaCl对照组相比,经100μmol/L DDC处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度为1 bp的缺失频率亦较低(P=0.009);和DMSO对照组相比,经25μmol/L 5-MF处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度大于1 bp的插入和缺失频率亦有所下降(均P=0.000)。结论·该研究建立的体外检测方法可用于分析AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件。Polβ抑制剂DDC和5-MF对由AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件具有抑制作用。