低浓度补体C3对大脑皮层神经元生物活性及突起生长的影响

目的探讨补体C3对大脑皮层神经元生物活性和突起生长的影响及可能机制。方法在原代培养的孕16 d大鼠胚胎皮层神经元中分别加入不同浓度的外源性C3蛋白、神经生长因子和C3a受体拮抗剂SB290157。WST-8法测定神经元活性（细胞存活率）。选用MAP2与β-tubulin免疫荧光细胞化学双标染色,荧光显微镜下观察并计算神经元纯度;应用神经元形态分析软件采集神经元树突、轴突长度及胞体面积等数据,分析不同浓度补体C3及C3a受体拮抗剂对突起生长的影响。以不含其他试剂的神经元细胞及其培养液作为正常对照组。结果皮层神经元存活率检测显示,高浓度（10-100μg/mL）C3组明显低于正常对照组（P〈0.05）,而低浓度（0.01-1μg/mL）C3组与对照组无明显差异。1μg/mL和5μg/mL C3均促进皮层神经元突起生长,尤其是轴突的生长,其树突和轴突长度分别增长20%-39%和40%-61%,与正常对照组比较有显著差异（P〈0.05和P〈0.01）;而加入C3a受体拮抗剂后,皮层神经元树突和轴突长度与对照组比较无明显差异。结论低浓度补体C3对皮层神经元轴突和树突生长有明显促进作用,而该作用可能由C3活性片段C3a受体介导。

少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立

目的对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程。方法通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养;再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)。OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定。结果 95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5;在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性;进入分化进程的细胞将依次表达O4、O1、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原。结论分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的O2A前体细胞(体内OPCs)相类似。

硫酸软骨素蛋白多糖Versican V1和V2亚型在大鼠损伤脊髓中的表达

目的探讨硫酸软骨素蛋白多糖Versican V1和V2亚型在成年大鼠损伤脊髓中的表达规律。方法 39只成年大鼠随机分为对照组(假手术组,n=9)和实验组(n=30)。利用纽约大学重物坠落装置建立实验组大鼠脊髓损伤模型。采用实时定量PCR、免疫组织化学法和免疫荧光法,分别观察大鼠脊髓损伤后Versi can V1和V2亚型的表达变化。结果实时定量PCR显示,与对照组比较,实验组Versican V1 mRNA的表达在脊髓损伤后4 h略有升高(P>0.05),损伤后1 d达到峰值(P<0.01),其高表达可维持至损伤后7 d(P<0.01);Versican V2 mRNA的表达升高较迟缓,脊髓损伤后1 d略有升高(P>0.05),峰值出现在损伤后7 d(P<0.01),然后迅速降低,损伤后14 d接近对照组水平(P>0.05)。免疫组织化学检测显示,脊髓损伤后3 d,包括损伤中心在内的10 mm全长脊髓都可观察到Versican表达明显增强;免疫荧光染色显示,高表达Versican的细胞为βⅢ-tubulin阳性神经元、GFAP阳性星型胶质细胞和MBP阳性少突胶质细胞。结论 Versican表达增强可能与脊髓损伤后形成抑制神经再生的微环境有关;消除其影响作用时,应考虑在不同时间采用不同方法处理表达模式不同的Versican亚型。

外源性CYR61基因转染与整合素分子表达的关系

目的探讨外源性CYR61在人外周血单个核细胞(PBMC)中表达后诱导其配体——整合素表达上调的生物学特性。方法构建人源全长CYR61真核重组表达质粒pcDNA-CYR61-Fc,经DNA测序确认其序列正确后,将该质粒转染COS7细胞并用蛋白免疫印迹实验检测其蛋白的表达;用脂质体法转染人PBMC,实时定量PCR检测CYR61表达量和相关整合素的表达格局。结果测序显示所构建的CYR61重组表达质粒序列正确;将该质粒转染COS7细胞后,免疫印迹实验表明转染的细胞胞浆和营养液上清中都含有CYR61-Fc融合蛋白;将该质粒转染人PBMC,经植物凝集素刺激后,外源性CYR61迅速表达,24 h后表达量达到高峰,然后迅速下降,48 h后基本回落,整合素分子αv、αM、β3及β5表达明显上调(P<0.05),以β5最为显著(P<0.01)。结论成功构建的pcDNA-CYR61-Fc真核表达质粒能有效地表达和分泌CYR61-Fc融合蛋白;表达的融合蛋白通过自分泌或旁分泌途径上调PBMC整合素分子的表达。