土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取

建立了一种土壤DNA提取方法。根据DNA产量和纯度2个评价指标,从3种手提土壤DNA方法中优选出方法B为手提DNA方法(Labmethod),它包括样品预处理,细胞裂解,粗DNA纯化,其中细胞裂解组合了玻璃珠击打,SDS裂解,溶菌酶裂解。进一步应用PCR-限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术及PCR-温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技术,结合DNA产量、纯度、片段大小以及所反映的微生物群落结构特性等指标评价了手提方法(Labmethod)得到的总DNA质量,并将这些结果与2种应用较广的商业试剂盒(MoBioUltraCleanSoilDNAKit和Bio101FastDNASPINKit(ForSoil))所得DNA的各种指标进行了比较。结果表明,手提方法(Labmethod)的粗DNA产量低于Bio101Kit的,但高于MoBioKit的。这些方法所得DNA的长度都在21kb左右,Labmethod提取的DNA没有严重被剪切现象,而2种试剂盒提取的DNA都有不同程度的剪切。手提方法得到的DNA经纯化后,应用细菌及真菌特异引物进行PCR扩增,均能获得目的片段,表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA。并且,手提方法所得DNA的细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱与两种商业试剂盒的图谱基本相似,但3种方法提取的DNA在细菌16SrDNAV3区和真菌28SrDNA片段的PCR-TGGE图谱上都存在一定差异,主要表现在一些弱势条带的有无或强弱上。这说明手提方法提取的总DNA与2种商业试剂盒一样,在一定程度上能反映微生物群落的多样性和组成。总之,手提DNA方法(Labmethod)所用试剂普通,价格便宜,能在4h以内获得够质够量的土壤DNA用于微生物分子生态学研究,较适合于广大普通实验室进行土壤DNA提取工作。

分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用

应用PCR—DGGE技术对某微生物肥料的质量进行了跟踪监测，并结合分离培养和克隆文库分析对其菌种组成进行了检测。结果表明，同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌DGGE（denaturing gradient gel eleetrophoresis）图谱相似性为80％-100％，3个不同生产批次之间DGGE图谱相似性为80％-88％，表明该微生物肥料的菌种组成的稳定性较好。但分离培养和克隆文库分析结果显示样品的菌种组成与产品标签说明之间存在较大差异。对于产品标注的6种微生物组成，只有Lactobacillus属的微生物可与之对应，其他检测到的Bacillus、Monascus、Brevibacillus、Psudomonas和Penicillium属的微生物并未包括在产品说明中。研究表明用分子生态学方法可以比较客观准确的对微生物肥料质量进行评估和峪测。

用PCR指纹图技术分析焦化废水接触氧化池中悬浮污泥和生物膜的微生物种群组成

目的 :应用分子生物学方法 ,以处理焦化工业废水 (A2 /O生物膜工艺 )中的悬浮污泥和生物膜的微生物群落作为研究对象 ,分析不同环境微生物群落的组成差异。方法 :首先提取群落的总DNA ,获得ERIC PCR和LP RAPD指纹图谱并进行对比分析 ,然后结合群落探针杂交的技术 ,检查同样迁移率的条带的序列同源性 ,运用UVIBAND/MAP软件比较所得群落指纹图谱的相似性指数 ,从而可以得到群落差异的量化结果。结果 :焦化废水接触氧化池中 ,悬浮污泥和生物膜的微生物群落组成存在相当大的差异。结论 :通过这种差异的比较分析 ,有可能让我们更准确地了解氧化池中微生物的群落组成情况 。

PCR指纹图谱技术分析人体口腔内微生物菌群结构

目的 应用PCR-DGGE指纹图谱技术对人体口腔微生物菌群结构进行系统性研究.方法 对1例健康人唾液周期性采集的样品和8例健康人个体的唾液与牙菌斑采集的样品,进行微生物群落总DNA的抽提.以此为模板扩增16S rRNA V3可变区,产物经DGGE指纹图谱分析其组成结构,并运用UVIBAND/MAP等软件比较所得群落指纹图谱的相似性指数.结果 同一健康人个体不同采样时间的唾液菌群结构相似性系数＞74%,通过对不同健康个体口腔样本的研究,发现同一个体的唾液与牙菌斑菌群结构存在差异（84%～95%）.结论 同一健康个体其唾液微生物菌群在一定时间内基本稳定,仅有微小的变化;唾液与同个体牙菌斑的微生物组成虽然存在差异,但这种差异要明显小于个体间的差异.

秸秆还田后土壤微生物群落结构变化的初步研究

通过实验室条件下的小麦秸秆粉和油菜秸秆粉的还土试验,结合常规的分析手段和基于DNA的分子技术(变性梯度凝胶电泳(DGGE)及测序技术),初步研究了秸秆粉还田后土壤物理化学特性及生物学特性的变化。结果表明,培养60d后,秸秆还田土壤的肥力明显提高,其纤维素酶活性明显增强。DGGE图谱表明,对照土壤(S)以及处理土壤(SW和SR),在培养过程中,β-Proteobacteria类细菌组成都在发生变化。对其中一个样品的DGGE条带进行了割胶测序,测序结果表明,大部分条带代表的微生物是未培养的或不可培养的。采用传统分离培养技术,从秸秆还田土壤中分离了2株纤维素降解菌。以上结果说明,秸秆还田具有良好的土壤综合效应。

焦化废水处理系统微生物群落结构动态的ERIC-PCR指纹图谱分析

ERIC PCR群落指纹图谱监测与常规技术相结合 ,分析了焦化废水处理系统曝气池的微生物群落结构动态变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系 .在每 3d 1次 ,连续 8个时间点的监测中 ,待处理废水中苯酚负荷在 35 5 3mg L和132 82mg L之间波动 ,氰化物负荷从 0 96mg L变化到 34 75mg L ,CODCr最低为 10 4 4 10mg L ,最高时为 7930 90mg L .第 4监测期间高浓度矿物油冲击使活性污泥的沉降能力和对CODCr的降解效率显著降低 ,但对苯酚和氰化物的降解能力造成的影响较小 .监测期间 2个曝气池微生物群落的ERIC PCR指纹图谱的平均相似性系数 (Cs)分别为 94 1%和 96 6 % ,多样性指数在 1 77— 2 34和 1 6 0— 2 16之间 ,表明用ERIC PCR检测出的该系统中的活性污泥这部分微生物种群的结构比较稳定 ,可能构成了苯酚和氰化物去除效率在监测期间相对稳定的基础 .

慢性牙周炎龈下菌斑和唾液微生物群落分析

目的:运用DGGE技术检测慢性牙周炎龈下菌斑和唾液微生物群落结构,分析其菌群之间的关系。方法:选取34名慢性牙周炎志愿者,分别采集龈下菌斑和唾液样本,采用PCR扩增细菌16Sr RNA V3区后,运用DGGE技术分析各组样本微生物群落结构。通过数字化软件Im age J将DGGE凝胶图谱转成数字信息,对所得矩阵进行主成分分析(Princ ipal ComponentAnalysis,PCA)、聚类分析(C luster Analysis)和偏最小二乘法(Partial Least Squares,PLS)分析。结果:DGGE图谱显示:龈下菌斑DGGE条带数目为11～28,,平均19;唾液DGGE条带数目为11～24,平均17;PCA结果显示:龈下菌斑与唾液比较有明显的差异;聚类分析显示:龈下菌斑、唾液形成5个明显聚类群,在同一聚类群中相似度高,在不同聚类群中相似度低,表示龈下菌斑与唾液菌群之间有显著差异;PLS结果显示:慢性牙周炎龈下菌斑与唾液菌群有显著差异。结论:DGGE是一种能直观显示微生物群落的指纹技术。通过该技术能检测牙周、唾液微生物群落的结构和组成,本结果显示,慢性牙周炎龈下菌斑与唾液微生物群落结构有明显差异。

土壤微生物在不同纤维素富集条件下的多样性

应用PCR-DGGE分子技术并结合聚类分析、主成分分析(PCA)等统计分析方法,对土壤微生物在几种不同的纤维素富集培养条件下的多样性进行分析。结果发现,不同的纤维素富集培养条件对土壤微生物的多样性有不同程度的影响:CMC和PCS两种培养基在50℃时所回收的土壤微生物的菌群结构和组成比较相似;纤维素富集培养基(J培养基)同CMC两种培养基所回收的土壤微生物菌群结构和组成却有很大的差异;50℃条件下所回收的土壤微生物其菌群结构和组成同28℃、37℃两个温度相比也相差较大。这一结果表明,组合不同的纤维素富集培养条件,结合分子和统计分析,可以对土壤样品在不同纤维素富集培养条件下微生物的多样性进行检测和评估,同时还可以为分离目标菌时富集培养条件的选择提供很有价值的参考。

牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落分析

目的:分析牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落的结构。方法:选取30名牙周健康志愿者,分别采集龈上菌斑及唾液样本,经DNA抽提与PCR扩增细菌16Sr RNA V3区后,运用DGGE技术分析各组样本微生物群落结构;并采用主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)及偏最小二乘法(PLS)分析两组间检出水平存在明显差异的条带,通过割胶测序确定与区别条带最相近的微生物。结果:PCA、CA、PLS结果均显示,牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物组成存在一定差异(P<0.05);测序结果提示,黄褐二氧化碳噬纤维菌、长奈瑟球菌和微黄奈瑟球菌在龈上菌斑内为优势菌群,而澳大利亚链球菌、谭氏普氏菌和黏滑罗斯菌在唾液内为优势菌群。结论:牙周健康者龈上菌斑与唾液微生物群落存在生物多样性及差异。

运用DGGE分析慢性牙周炎患者唾液微生物群落结构

目的运用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术,分析慢性牙周炎患者唾液中微生物群落结构。方法采集33名慢性牙周炎志愿者(P组)和15名非慢性牙周炎志愿者(NP组)唾液样本,共计48份。运用DGGE技术分析两组样本微生物群落结构,然后将DGGE凝胶图谱转化成数字信息,进行主成分分析(Principal Component A-nalysis,PCA)、聚类分析(Cluster Analysis)和偏最小二乘法(Partial Least Squares,PLS)分析。结果 PCA显示P组和NP组没有形成两个明显的聚类群;聚类分析显示两组大部分样本没有形成聚类现象,但少数样本形成聚类现象;PLS显示两组大部分样本形成聚类现象,仅少数样本没有形成聚类现象。结论慢性牙周炎组和非慢性牙周炎组的唾液微生物群落结构没有显著差异,但存在产生差异的趋势。

应用PCR与温度梯度凝胶电泳分析龈上菌斑微生物群落

目的应用PCR与温度梯度凝胶电泳(PCRTGGE)分子技术对成年健康口腔的龈上菌斑中微生物群落组成进行分析。方法8例成年个体包括4男4女,年龄19～29岁,分别采取每例个体上下颌牙周龈上菌斑样品,共18份(个体Subl间隔10天采集2次样品)。提取菌斑DNA,PCR扩增16SrDNAV3可变区,产物经TGGE后进行相似系数分析。结果同一个体的上下颌微生物群落组成相似性系数为81%～95%,而不同个体的龈上菌斑微生物群落组成相似性系数,均在60%以下。结论不同个体具有其独特的牙周微生物群落,而且在一定时期内组成稳定。

蝗虫肠道微生物总DNA提取方法的比较

采用Bead beating法和QIAamp DNA stool mini kit法提取蝗虫肠道微生物总DNA,并对2种方法提取DNA的得率、完整性以及16SrRNA基因扩增产物的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)图谱等进行综合比较。结果表明,Bead beating法提取DNA的得率显著高于QIAamp DNA stool mini kit法(P=0.042),而QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA片段更完整。PCR-DGGE检测微生物多样性结果显示,QIAamp DNA stool mini kit法提取DNA所代表的微生物群落多样性略高于Bead beating法,但Mann-Whitley统计学检验表明用2种方法检测蝗虫肠道微生物多样性无显著差异(P=0.17)。因此在蝗虫肠道微生物群落多样性的检测中QIAamp DNA stool mini kit法具一定的优势,而Bead beating法同样适用。

ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构

目的 了解大熊猫肠道微生物区系结构的相似性和稳定性,并找出大熊猫肠道微生物群落结构的变化与健康状况的关系。方法 对上海动物园及上海野生动物园所饲养的3只大熊猫2次采集的粪便样品进行微生物群落总DNA的抽提,并以此为模板获得反映肠道微生物群落结构特征的ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱,比较各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果 除国庆(大熊猫)的第1次采集的样品(当时处于腹泻状态) ,其他各DNA样品的ERIC- PCR及Southern杂交指纹图谱的相似性都达到85 %～10 0 % ;佳斯及川川(大熊猫) 2个个体2次采集的样品之间ERIC指纹图谱的相似性分别为93%和87% ,而国庆腹泻时的样品与健康时的样品之间则为71%。结论 大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比较相似,而且同一个体在不同时期表现出比较高的稳定性,但当个体的健康出现问题时肠道优势菌菌群结构有一定波动。所采用的DNA提取方法、ERIC- PCR和Southern杂交指纹图谱的高度重复性证明了之一分子生态学技术在大熊猫肠道微生物区系动态监测中的可行性。

中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征的微生态研究

目的 :应用分子生物学的实验方法和技术研究中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征。方法 :直接从运动员粪便样品中提取细菌总DNA ,并以此为模板进行PCR扩增 ,得到不同运动个体胃肠细菌基因指纹图 ;然后将 1名运动员的PCR产物用地高辛标记为探针 ,与其余 6名运动个体的胃肠细菌指纹图进行核酸印迹杂交 ;最后对目的基因片段进行克隆和测序。结果 :(1)不同运动个体胃肠菌群中既存在共有菌群 ,又存在个体特征菌群 ;(2 )普遍存在于运动员胃肠道中的某种特征菌群 ,在基因库中无与其同源的序列 ,可能是一种尚未被报道的新型菌群。

从粪便样品中检测动物冠状病毒的分子技术研究

目的感染冠状病毒的动物向环境排毒主要是通过粪便,建立直接从粪便样品对动物冠状病毒进行检测的分子技术具有重要的公共卫生学意义。方法通过计算机模拟和实验方法对已报道的2对针对冠状病毒pol基因的通用引物的通用性进行了验证。不经传统的病毒分离,直接从环境样品中提取病毒RNA,通过一步法RT-PCR进行检测,并通过分子杂交和NestedPCR扩增结合TaqMan探针实时荧光检测的PCR技术,提高对冠状病毒检测的灵敏度和准确度,并对猪、禽冠状病毒感染的临床样品进行分析检测。结果2对引物可以覆盖所有已知的冠状病毒,包括SARS,RT-PCR产物通过测序可以确定冠状病毒种类;实时荧光定量NestedPCR有很高的灵敏度,可以灵敏地检出所有供试的阳性样品,而荧光增量实时监测可以排除凝胶电泳检查的假阳性。结论该研究为从环境中普查和鉴定冠状病毒提供了可靠的技术方法。

采用DNA指纹图谱技术分析中长跑运动员肠道菌群结构特征

目的 :用DNA指纹图谱技术分析中长跑运动员肠道菌群区系结构的特征。方法 :对 7名中长跑运动员进行连续 6天的跟踪观察 ,直接从其粪便样品中提取出总DNA为模板 ,进行ERIC-PCR扩增 ,得到反映肠道微生物菌群结构特征的DNA指纹图。结果 :根据图谱多样性指数变化和相似性系数值的分布特征 ,受试运动员表现出两种类型 :一类菌群区系结构稳定 ,受运动负荷变化影响较小 ;另一类菌群区系结构随运动负荷的增减出现较大波动。结果表明 :运动员DNA指纹图谱特征存在明显个体差异 ;运动负荷的变化可能改变运动员肠道菌群区系结构。提示稳定的菌群结构可能是运动员在剧烈运动条件下保持良好机能状态的重要因素之一。

ERIC-PCR指纹图谱技术分析糖尿病小鼠肠道细菌群落变化

目的通过比较1型糖尿病模型组和空白对照组雄性小鼠肠道菌群结构的变化,探索糖尿病造模与肠道菌群的关系。方法收集造模2周后空白对照组(n=5)、STZ造模成功组(n=5)和造模不成功组(n=3)ICR小鼠的新鲜粪便样品,提取粪便样品的总DNA,ERIC-PCR扩增形成DNA指纹图谱,借助多变量统计分析方法研究各组样品肠道菌群结构上的异同。结果ERIC-PCR指纹图谱结合偏最小二乘法(PLS-DA)分析表明造模成功组和造模不成功组小鼠的肠道菌群结构显著区别于空白对照组,而造模不成功组小鼠的肠道菌群结构与造模成功组仍有一定的区别。结论STZ诱导的1型糖尿病会造成小鼠的肠道菌群结构的变化,而部分小鼠造模失败可能与这些小鼠的肠道菌群结构有关。

无苯酚培养基分离到的降酚菌多样性的分子分析

用3种不含苯酚的培养基(YPG、10%YPG和LB)从上海焦化厂废水处理系统(A2/O法)好氧池的悬浮污泥分离到24株降酚菌株.通过16SrDNAPCR扩增产物的限制性酶切分析(amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、ERICPCR指纹图谱分析、多组分苯酚羟化酶大亚基(thelargestsubunitofthemulticomponentphenolhydroxylase,LmPH)基因的PCR扩增及16SrRNA基因测序的方法对这些降酚菌株进行表征.通过ARDRA分型,将这24株降酚菌株分为8个类型;利用ERICPCR可以将这24个菌株分为17种类型,说明同一ARDRA类型内菌株具有多样性.对17个ERIC类型代表菌株的16SrDNA扩增产物进行克隆并测序,测序结果在GenBank和RDP中进行比对.结果表明,与这17个代表菌株同源性最高的菌中,有6株是未见报道具有降酚功能的菌株.在这24株降酚菌中,有19株在苯酚含量为200mg/L的MP培养基中培养5d,苯酚降解率为20%左右,其余5株苯酚降解率达到100%,且均属于Rhodococcus属.本研究在降酚菌生物多样性上作了有益的探索.

对降解喹啉的厌氧生物反应器中重要功能菌群的鉴定

通过把微生物区系组成的分子水平的动态变化情况与微生物群落的整体功能变化相关联,鉴定重要的功能类群是微生物分子生态学研究的一个重要的策略。应用分子生物学的方法,对一个实验室规模的用于降解喹啉的厌氧反应器生物膜样品的微生物区系组成变化进行解析,找出可能的主要功能菌。通过DGGE对反应器的种子污泥和运行稳定的厌氧生物膜反应器的微生物区系组成进行了对比分析,并对主要的优势条带进行了分子鉴定。同时对以上两个样品构建16SrDNA克隆文库,通过统计学分析对克隆文库的有效性进行验证,并对文库进行测序分析。DGGE条带及克隆文库的序列分析均表明,在驯化过程中,GammaProteobacteria亚纲与Desulfobacterpostgatei种的微生物显著增加,这种动态变化表明这些细菌可能是在厌氧条件下对喹啉的降解起关键作用的微生物。

粪便样品中大肠杆菌多态性分子研究

以粪便样品中分离到的大肠杆菌为研究对象,比较了3种不同方法在分离鉴定大肠杆菌过程中的应用。首先,通过传统方法从粪便样品中分离,筛选和确定了一批大肠杆菌疑似菌株,再用现代分子生物学方法对待鉴定的大肠杆菌疑似菌株,已知大肠杆菌MG1655以及几种其它细菌进行ARDRA(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis)分析,最后利用ERIC-PCR技术在个体水平上分析菌株的多样性。结果表明,所有由传统方法确定的大肠杆菌疑似菌株和MG1655都属于同一ARDRA型,并与其它细菌的ARDRA条码型不同。这说明ARDRA分析得到的结果与传统分析方法的结果吻合,利用ARDRA分析可以区分大肠杆菌和其它肠道细菌。但是在本实验中ARDRA分析不能反映大肠杆菌中不同菌株之间的多样性,ERIC-PCR则可以区分它们。