基于核酸保护原理的 DNA芯片检测技术

制备出 3′-末端与载玻片交联、 5′-末端用 32P标记的检测 DNA的芯片，方法以化学法合成了3′-末端为尿嘧啶核糖的寡聚脱氧核糖核苷酸片段。用 32P标记寡核苷酸的 5′-末端，经过高碘酸氧化后与玻璃基片表面的脂肪胺基缩合，并用硼氢化钠还原，制成寡核苷酸 3′-末端与玻片共价交联、 5′-末端为同位素标记的 DNA芯片。将该芯片与液相中的核酸片段杂交，再用核酸酶 S1酶切。结果当液相中的核酸与玻片上共价交联的寡核苷酸片段产生特异性杂交配对时，核酸酶 S1不能酶切玻片上的寡核苷酸片段，且玻片上被保护的寡核苷酸量与液相中的与它配对的核酸量之间呈线性相关（ r=0.9967,P< 0.001, n=7)。结论上述检测法可以定性和定量地检测液相中的核酸。由于该法制备的 DNA芯片各个位点的 DNA探针的含量为已知，待测的核酸样品无需进行同位素或荧光标记，操作简便，适用于对样品的 DNA或 RNA进行检测。

家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR-DGGE和16S rDNA文库序列分析

采用基于16S rDNA的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和16S rDNA文库序列分析的手段,研究了重要经济昆虫家蚕Bombyxmori2个品系——专食性品系C108和广食性品系SCN2幼虫中肠内的细菌群落多样性,同时还探讨了食料对家蚕中肠内细菌群落结构的影响。文库序列分析表明,PCR扩增得到的16S rDNA基因代表了家蚕中肠内的41种细菌系统发育型(phylotype),大多数属于Proteobacteria,其次是Lactobacillales。此外,还有少数属于Deinococcus-Thermus、Bacillales、Clostridiales和Actinobacteria,尚有5种系统发育型不能确定其所属类型。家蚕的这2个品系中,肠球菌属Enterococcus是其中肠细菌的优势菌群,栖热菌属Thermus是次优势菌群。优势菌肠球菌属的组成在品系和不同食料喂养条件下有着一定的变化,无桑饲料喂养条件下SCN2品系中肠内还出现了新的次优势菌葡萄球菌(Staphylococcus)。DGGE图谱显示家蚕低龄幼虫和高龄幼虫肠道细菌格局存在差异,推测可能与其发育期生理状态的差异有关。本研究结果提示家蚕肠道特殊菌群的出现可能与其特殊的食性有一定的关系,食料改变、生长受阻后肠道微生态平衡也发生变化。

枸杞体细胞胚发生中Ca^(2+)和ATPase的超微结构定位研究

研究2,4-D诱导枸杞体细胞胚发生中的作用及其与Ca^(2+)含量和ATPase活性时空分布动态之间的关系,以探讨2,4-D诱导植物体细胞胚发生的作用机理。采用超微细胞化学定位的方法,跟踪分析了体细胞胚发生与发育的不同时期,Ca^(2+)和ATPase活性的时空分布动态。结果表明:2,4-D是诱导离体培养的枸杞体细胞进入胚胎状态的关键激素。在含有2,4-D和不含2,4-D的培养条件下,分别诱导枸杞体细胞脱分化后,再转入除去2,4-D的MS培养基上,进行分化培养,结果前者可分化形成体细胞胚,因而称为胚性愈伤组织。后者在相同条件却不能分化形成胚,故称为非胚性愈伤组织。在2,4-D诱导枸杞的胚性愈伤组织中,胚性细胞分化早期的细胞间隙和细胞壁上均有Ca^(2+)沉淀。随着胚性细胞的分化、分裂和多细胞原胚形成,这时Ca^(2+)在细胞内的分布主要集中在细胞膜和液泡膜上;球形胚期在细胞核中Ca^(2+)呈弥散性分布。在此过程中,ATPase活性时空分布与Ca^(2+)的定位变化具有高度一致性,仅仅稍滞后于Ca^(2+)出现的时间。而在胚性细胞分化早期,ATPase活性同样位于质膜上,随后在液泡和细胞核都可见ATPase活性分布。而在非胚性愈伤组织中,则未见Ca^(2+)和ATPase活性呈时空动态分布,而且随着非胚性细胞的液泡化,无论是Ca^(2+)含量,还是ATPase活性都呈逐渐降低的趋势。表明Ca^(2+)和ATPase活性变化与2,4-D诱导的胚性细胞分化和发育密切相关。并由此推测,Ca^(2+)和ATPase的时空分布对胚性细胞分化中的信息传递和调控相关基因表达起着关键性作用。

黄鳝性别决定与SRY基因不相关

以人和鼠的SRY片断为探针与黄鳝基因组DNA进行杂交,发现雌雄黄鳝中均有相同的杂交带.用一对SRY基因保守区HMG box的引物,在雌雄黄鳝的基因组DNA中均扩增出约200 bp片段.将此片断克隆测序后发现雌雄个体中此片断仅相差1个bp,且与人的SRY基因HMG盒基因极相似.以该片段与雌雄个体的RNA进行Northern杂交未能检测到杂交带,RT-PCR反应扩增出一条微弱的200 bp片段.以上结果表明:在雌雄黄鳝的基因组DNA中均存在SRY同源片断;黄鳝中的SRY同源片断可能与其性别无直接关系,而是具备其他功能,由此推测低等脊椎动物的性别决定可能由其他基因控制.

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA ,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明 ,zot基因编码 399个氨基酸 ,其中 4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET 2 8(a +)构建表达质粒 pET ZOT ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经 1mmol/LIPTG诱导表达 3～ 5h后 ,表达大量ZOT蛋白 ,并形成包涵体。经SDS PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为 47kD ,凝胶自动扫描分析表明 ,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的 15 %以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。

内含子编码蛋白与内含子的转移

具有自我剪接能力的Ⅰ型和Ⅱ型内含子有编码蛋白质的功能。Ⅰ型内含子编码成熟酶和核酸内切酶，后者参与Ⅰ型内含子的归巢。Ⅱ型内含子编码的蛋白质呈现成熟酶核酸内切酶和逆转录酶活性，三种活性都在Ⅱ型内含子归巢中起作用。除归巢外，Ⅰ型和Ⅱ型内含子的转移还表现为转位和丢失。内含子作为可转移遗传因子，可能在进化中有一定的意义。

基于电化学法的农药污染检测专用软件设计

为实现农药污染定量检测,通过酶水解底物发生电化学反应产生电子,用电信号减弱的比率量化酶活性被农药抑制的程度,利用抑制率与农药浓度之间的量化关系来估计农药浓度。根据这一方法设计农药污染检测专用软件,控制电化学工作站提取酶电极传感器信号,测量原始酶和被样品抑制的酶水解底物产生的电流信号大小并计算抑制率,最后搜索、比对数据库并显示样品的农药污染检测结果。利用敌敌畏与克百威两种农药配置不同浓度的样品进行实验,在检测结果判定的主要浓度范围时,专用软件的测量误差在10%以内,以抑制率大于50%作为样品呈阳性的条件,单次检测的假阴性概率小于11.1%。

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明，该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基，其中对个为信号肽，成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性，不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列，克隆到pT7ZZ表达质粒中，转化E.coliBL21（DE3）后，经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。

中国仓鼠卵细胞二氢叶酸还原酶基因在大肠杆菌中的高效表达

本工作采用PCR法将哺乳动物表达载体pSVA75上的中国白鼠卵细胞（CHO）二氧叶酸还原酶基因扩增后插入到原核生物高效表达质粒pBV221中，构建成胞内表达载体pDHFR—1，经转化大肠杆菌（E．coliDH5α）的后获高效表达，表达量占总蛋白量的12．2％．利用这种方法不仅为深入研究该酶的结构和功能的关系及其新生肽键的折叠提供丰富的实验材料，而且也有希望成为较好的外源DNA原核扩增表达系统。

454焦磷酸测序分析几种哺乳动物粪便细菌多样性

【目的】分析比较几种哺乳动物粪便细菌群落多样性,了解粪便细菌多样性与动物进化和食物的关系。【方法】采集6种哺乳动物粪便样品;提取总DNA;PCR扩增,获得16S rDNA V3标签片段;用454焦磷酸测序技术进行高通量测序;主要基于QIIME平台分析比较粪便细菌多样性。【结果】分析发现,厚壁菌门和拟杆菌门广泛存在于各样品中,并且占绝对优势。α多样性分析发现,杂食性的长臂猿、黑猩猩和川金丝猴的多样性最高,其次是肉食性的东北虎,来自熊科杂食性的亚洲黑熊和大熊猫的多样性最低。β多样性分析发现,白眉长臂猿、黑猩猩、川金丝猴几种灵长目动物粪便的菌群相似,而大熊猫菌、黑熊、孟加拉虎几种食肉目动物粪便细菌群相似但食肉动物孟加拉虎主要又因含梭杆菌门而区别于其他动物。【结论】动物粪便细菌优势类群明显;同种动物重复样本的相似性最高,各种动物多样性存在差异,但几种灵长类动物粪便细菌多样性更丰富;动物粪便细菌的组成和动物的进化及食物相关。本研究为哺乳动物粪便菌资源及后续研究提供了借鉴。