针灸治疗支气管哮喘的实验研究进展

哮喘已经成为世界范围内的常见病、多发病。支气管哮喘是以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性气道炎症,属于中医学哮病范畴。针灸治疗哮喘历史悠久、疗效肯定,其机理研究可为临床提供理论依据,现将近几年来的实验研究进展进行综述。

实验性碱烧伤角膜新生血管的观察研究

目的利用碱烧伤诱导实验性角膜新生血管(CRNV)的发生,探讨定量分析CRNV和观察CRNV通透性的方法。方法取36只C57BL/6小鼠,随机分为:实验组(n=30):采用浸润l mol/L NaOH的滤纸片接触角膜5 s,诱导碱烧伤CRNV;对照组(n=6):不进行任何处理。于碱烧伤后第4、7、10、14天测量CRNV面积;第3、7、10、16、28天取眼球做切片的HE染色行组织学检查;第10天使用CD31抗体标记CRNV并计数,行荧光血管造影观察CRNV的通透性;每日观察角膜溃疡和前房积血等情况。结果实验性碱烧伤CRNV存在生长和消退的过程。无菌性角膜溃疡和前房积血较为常见,发生率分别为6.7%和10.0%。眼球切片的HE染色可观察到不同时间角膜组织的病理变化。碱烧伤后第10天,CD31抗体免疫组化标记并记数CRNV,荧光血管造影可观察到显著的CRNV渗漏。结论CD31抗体免疫组化标记、记数CRNV及联合CRNV面积测量,是CRNV定量分析较为客观的方法;荧光造影是观察和记录CRNV通透性可行的方法。

脉冲等离子体涂层神经导管修复周围神经缺损实验研究

目的:探讨经脉冲等离子体涂层并固定睫状神经营养因子(CNTF)的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物(PGLA)神经导管修复周围神经缺损的效果。方法:应用脉冲等离子方法对PGLA膜片或神经导管表面进行处理,然后固定CNTF。该膜片表面种植人胚胎视神经细胞,经处理的神经导管修复SD大鼠坐骨神经1.5cm缺损。观察人胚胎视神经细胞在经处理的膜片上生长情况,并用电生理和轴突计数法评价经处理的神经导管内神经再生质量。设立未固定CNTF的PGLA膜片组和未经过脉冲等离子体涂层的神经导管组作为对照组比较。结果:在经处理的PGLA膜片上,人胚胎视神经细胞生长较对照组密集,且发现有轴突延伸相接现象。经处理的PGLA修复大鼠坐骨神经缺损,在1个月和3个月时,均发现神经导管内神经传导速度和再生神经轴突均明显大于对照组(P<0.05)。结论:经脉冲等离子体涂层并固定睫状神经营养因子(CNTF)的PGLA神经导管可能通过CNTF的接触诱导和持续缓释作用,促进周围神经再生。

血管及淋巴管生成相关基因表达与肿瘤转移率和转移途径的比较分析

目的：研究促进血管及淋巴管生成因子——血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-A、-C、-D表达水平与肿瘤转移率及转移途径的关系，探讨其在肿瘤转移方面所起的作用，以及是否可作为判断肿瘤转移和预后的指标。方法：建立2种小鼠和4种人的肿瘤动物模型，观察肺、肝及腹股沟、腋下、髂血管和腹主动脉旁淋巴结大小及肿瘤转移情况。实时荧光定量．PCR（real—time fluorogentic quantitative PCR，RFQ—PCR）检测体外培养的肿瘤细胞及小鼠体内生长的肿瘤组织内VEGF—A、-C、-D及血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）-2、-3和淋巴管内皮细胞标志物——淋巴内皮细胞透明质酸受体-1（lymphatic vessel endothelial HA receptor—1，LYVE—1）的表达水平。结果：2种小鼠和4种人的肿瘤动物模型中61％～100％出现了肺转移，16％～100％出现了肝转移，2种小鼠肿瘤动物模型中26％～100％出现了淋巴结转移。结果表明，VEGF—A在肿瘤组织中表达量的增加将伴随着更高的肝、肺转移率。肿瘤组织中VEGF—C的表达水平与肿瘤的淋巴转移存在相关性，但VEGF—D表达水平增加与肿瘤淋巴结转移的发生率并不平行。结论：VEGF—A表达水平与肿瘤血道转移关系密切，VEGF—C在肿瘤淋巴结转移中起重要作用。

依托泊苷提高复制缺陷型腺病毒介导外源基因在肿瘤细胞中的表达水平

目的：研究化疗药物依托泊苷对腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内表达水平的影响。方法：携带外源基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-EGFP（MOI为1或10）单独或联合终质量浓度为0．2、2、20、40、80、100和200μg／ml的依托泊苷感染体外培养的肿瘤细胞NCI-H446（人非小细胞肺癌细胞株）、A549（人肺腺癌细胞株）、SMMC-7721（人肝癌细胞株）、SGC7901（人胃癌细胞株）、SKBR-3（人乳腺癌细胞株）和BTT（小鼠膀胱移行上皮癌细胞株）后不同时间，流式细胞仪分析肿瘤细胞EGFP阳性率和平均荧光强度，Western blotting检测EGFP蛋白表达，RT—PCR和实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞内EGFP的mRNA表达量和DNA拷贝数。结果：不同剂量的依托泊苷可不同程度地提高Ad5-CMV-EGFP在7种肿瘤细胞内的表达水平，但对EGFP阳性率无明显提高。10 MOI的Ad5-CMV-EGFP联合40μg／ml依托泊苷分别感染肿瘤细胞NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SKBR-3和BTT 24h后，细胞内EGFP的荧光强度分别是单独感染的3．3、3．5、3．1、6．2、7．0、5．4和3．4倍。Ad5-CMV-EGFP联合应用依托泊苷后肿瘤细胞内EGFP蛋白表达增加2～5倍，EGFP mRNA表达量提高，但DNA拷贝数未见明显改变。结论：依托泊苷可提高腺病毒载体介导的外源基因在肿瘤细胞内的表达水平，该作用可能是在转录水平上发挥作用的。

靶向E2F1的shRNA抑制眼内视网膜母细胞瘤生长

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中由于Rb基因缺失或失活,转录调控因子E2F1始终处于活化状态,细胞不断增殖,E2F1活性增加是恶性肿瘤的普遍现象.根据人E2F1基因设计了3段shRNA,构建RNA干扰表达载体pSilencer-shE2F1,瞬时转染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb-44和人肝癌细胞株SMMC-7721,通过荧光定量PCR检测E2F1表达水平的变化,PI(碘化丙锭)染色检测细胞周期各时相细胞数量以检测其对细胞周期的影响.根据筛选出的有效shRNA序列构建腺病毒载体并包装出腺病毒Ad-shE2F1,在裸鼠前房模型中,体外按50moi的感染系数感染稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人视网膜母细胞瘤细胞株48h后,收集细胞,将2×105细胞注射到裸鼠眼前房内,连续观察眼内肿瘤细胞生长情况并拍照记录.通过转染肿瘤细胞株检测E2F1转录水平,筛选到1个能明显抑制肿瘤细胞内E2F1表达的shRNA序列,并使细胞周期中S期细胞数减少.经Ad-shE2F1感染的RB肿瘤细胞与对照相比较,其在裸鼠眼前房内肿瘤生长减缓.结果说明,有效抑制hE2F1表达的shRNA具有抑制体内外人视网膜母细胞瘤生长的作用.

白癜风患者维生素D受体Apa I,Bsm I,Fok I基因多态性分析

目的探讨维生素D受体Apa I,BsmI,Fok I基因多态性与白癜风的相关性。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法,对46例白癜风患者和50例健康人的维生素D受体Apa I,Bsm I,Fok I基因型进行分析。结果VDR-ApaI基因AA,Aa,aa基因型分布频率在白癜风组分别为6.52%,21.74%,71.74%,对照组分别为12.00%,42.00%,46.00%;VDR-Bsm I基因BB,Bb,bb基因型分布频率在白癜风组分别为2.17%,47.83%,50.00%,对照组分别为2.00%,20.00%,78.00%;VDR-Fok I基因FF,Ff,ff基因型分布频率在白癜风组分别为32.60%,52.17%,15.22%,对照组分别为32.00%,52.00%,16.00%。维生素D受体Apa I,BsmI位点上aa,Bb基因型在白癜风患者中频率较高(P=0.036;P=0.013)。结论携带维生素D受体aa,Bb基因型可能会增加患白癜风的易感性。

表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测

采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因,将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV,然后用重组质粒pSNAV-Ig-BDNF转染包装细胞,筛选出永久细胞株后,用携带腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞,成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病毒。经PCR鉴定该病毒含有目的基因片段,被该病毒感染的细胞裂解液经Western blotting证实有BDNF表达,其培养液经ELISA检测证实含有高水平的BDNF蛋白。该病毒与小量的非复制型腺病毒Ad-null联合应用时,其BDNF蛋白的表达水平显著提高。可弥补腺相关病毒起效慢、对细胞转导效率低的弱点,为今后应用AAV作基因治疗提供了实验证据。

腺病毒载体研究进展与展望

基因治疗自1990年第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床试验以来,一直在稳步发展.据不完全统计,目前在全世界范围内已有918个基因治疗方案进入临床试验,特别是在疑难疾病的治疗方面显示出巨大的应用潜力.

超声辐照人血白蛋白微球与腺相关病毒感染人视网膜色素上皮细胞

目的探讨超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球促进携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染人视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值。方法HRPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×105/孔),加入微球与rAAV2-EGFP的混合液,在不同条件下进行超声辐照。48h后,应用流式细胞仪测定阳性细胞比例,并且评估不同辐照条件对细胞增殖有无影响。结果在声强1.0W/cm2,辐照持续时间60s,微泡细胞比值60∶1的条件下,全氟丙烷人血白蛋白微球组EGFP阳性细胞比例较对照组显著提高(P<0.001),MTS染色细胞生存率大于90%。结论超声辐照全氟丙烷人血白蛋白微球能够安全地提高rAAV2-EGFP对人RPE细胞的感染效率。

二氯化钴对腺病毒基因表达的影响

目的:研究二氯化钴(CoCl2)对缺氧反应元件调控E1AE1B表达的条件复制型腺病毒载体(Ad-5HRE-E1AE1B-RFP)和缺乏缺氧反应元件的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-EGFP)在肿瘤细胞内表达和复制的影响。方法:肿瘤细胞经不同浓度的CoCl2处理后,Western印迹法检测缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达;倒置荧光显微镜、FCM法及空斑形成实验等观察经CoCl2处理后,感染条件复制型腺病毒和(或)复制缺陷型腺病毒的肿瘤细胞中外源基因的表达水平和病毒复制情况;小动物成像仪观察缺氧调控的条件复制型腺病毒在肿瘤内提高复制缺陷型腺病毒表达的效率。结果:适当浓度的CoCl2(0.4和0.08μg/mL)能使胃癌细胞株(SGC7901)中HIF-1α蛋白稳定表达并积聚,可较好地模拟缺氧状态;在0.4μg/mLCoCl2作用下,Ad-5HRE-E1AE1B-RFP对肿瘤细胞的感染效率明显提高,表现为外源基因RFP阳性表达的百分率和荧光强度均明显提高,但空斑形成实验显示Ad-5HRE-E1AE1B-RFP并没有复制。0.4μg/mLCoCl2也能提高其他非缺氧调控的复制缺陷型腺病毒如Ad-EGFP、Ad-Luc的感染效率和表达水平;Ad-5HRE-E1AE1B-RFP与复制缺陷型腺病毒Ad-Luc联合注射裸鼠肿瘤能显著提高Ad-Luc的表达。结论:CoCl2能明显提高腺病毒的基因表达水平,其作用机制不仅与CoCl2诱导缺氧有关,也可能与影响基因转录有关。

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有"细胞溶解"和"旁观者效应"而备受关注.构建了受热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果.体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上.此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍.

VEGF反义核酸调控兔VX2肿瘤早期血管生成的DCE-MRI研究

目的利用DCE-MRI监测血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸调控兔后腿VX2肿瘤早期血管生成的效果,评价反义基因抗血管生成治疗价值以及无创性影像监测方法。方法利用分子生物学方法构建兔VEGF反义基因真核表达载体。将30只新西兰大白兔,平均分5组(A、B、C组为治疗组,D、E组为对照组),建立后腿接种VX2肿瘤模型。采用两种反义基因导入方法,于最后一次反义基因导入后0、3、7天分别对各组动物行DCE-MRI检查,计算第一分钟最大强化斜率。采用Western Blot和免疫组织化学染色法分析肿瘤组织VEGF表达。结果与对照组比较,A组(治疗后0、3、7天)、B、C组(治疗后7天)肿瘤体积减小(P<0.05);A组(治疗后0天)、B、C组(治疗后3天)第一分钟最大强化斜率显著减低(P<0.01);A、B、C组VEGF表达明显减低(P<0.01)。结论①VEGF反义核酸可早期有效抑制兔VX2肿瘤VEGF表达,减少肿瘤血管形成,对肿瘤的生长具有抑制作用。②DCE-MRI可用于监测抗血管治疗早期血管通透性变化。

重组腺病毒介导绿色荧光蛋白基因对小鼠眼组织的转染和表达

目的研究不同剂量Ad5-EGFP前房注射后,报告基因在小鼠眼部组织的表达情况及分布特点。方法24只BALB/c小鼠随机分组。实验组以不同浓度梯度前房注射Ad5-EGFP。对照组前房分别注射PBS和不给予任何注射。观察活体眼部组织EGFP表达情况及阳性细胞的类型。结果低浓度注射组在各个时间点眼表均未观察到EGFP荧光表达。高浓度注射组在注射病毒第1d即可以观察EGFP的表达,在第10d时眼表EGFP荧光亮度、范围增加最为明显。EGFP在角膜内皮细胞、虹膜色素上皮细胞及小梁网阳性表达。结论Ad5型腺病毒载体定向携带报告基因在眼前节表达,为眼前节疾病的基因治疗提供了实验依据。

人肝癌细胞中缺氧反应元件对微环境的反应

目的:通过观察缺氧反应元件(hypoxia-response element,HRE)调控下,绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein,GFP)构建的肝癌细胞Bel-7402/5HRE-EGFP在缺氧条件下,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达水平的变化,研究HRE对微环境的反应特性。方法:以5个串连的HRE和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的微小启动子为转录调控元件、GFP为报告基因构建表达载体,应用FCM和细胞免疫染色法观察缺氧、一氧化氮、过氧化物和酸性pH等微环境的变化对人肝癌细胞Bel-7402中HRE活性的影响,以及缺氧条件下HIF-1α、VEGF表达水平的变化。观察缺氧探针哌莫硝唑的染色强度和分布与HIF-1α、VEGF和GFP表达强度和分布之间的关系,探求裸鼠体内肿瘤组织缺氧对HRE活性及其相关基因表达的影响。结果:肝癌细胞中HRE对缺氧非常敏感,肿瘤细胞和组织缺氧时可上调HIF-1α和VEGF的表达,两者的分布也基本一致。结论:缺氧在调控肝癌血管生成因子表达方面可能起着重要的作用。

免疫抑制剂对小鼠膀胱癌进程和转移的不同效应

利用稳定表达绿色荧光蛋白的高度恶性膀胱癌细胞株BTT-T739-gfp建立皮下肿瘤模型,对比分析在常规免疫抑制剂量下,环孢素、雷帕霉素在肿瘤发展和转移方面的不同效应及其可能的作用机制.24只T739小鼠随机分为对照组、环孢素组、雷帕霉素组.环孢素、雷帕霉素剂量分别为10mg/(kg·day)、1.5mg/(kg·day),腹腔注射.观察荷瘤小鼠生存情况,计算荷瘤容积变化,以及肿瘤在肺和肝脏的转移情况,分析其作用的可能机制.结果显示,常规免疫抑制剂量下,与对照组和环孢素组比较,雷帕霉素具有明显的抗肿瘤效应.雷帕霉素可显著提高荷瘤小鼠的生存,观察期末,对照组、环孢素组及雷帕霉素组小鼠荷瘤生存率分别为62.5%、50%、100%,环孢素组与雷帕霉素组差异显著,在观察期内与对照组、环孢素组比较,雷帕霉素可显著抑制负荷肿瘤的容积.雷帕霉素应用后,肿瘤内血管显著减少,肿瘤细胞分泌VEGF的能力明显降低,与肿瘤血管形成有关基因VEGF、HIF-1α的转录活化明显受到抑制.结果证实雷帕霉素具有显著的抗肿瘤效应,这一作用与其抑制肿瘤内血管形成明显相关.抑制VEGF-A、HIF-1α等促进血管形成因子的转录、表达是其主要的作用方式之一.

基因表达谱分析小鼠膀胱癌VEGF信号转导通路的作用

目的:探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤新生血管形成过程中的作用,与肿瘤生长、转移的关系及其作用机制。方法:通过转染反义VEGF表达质粒,建立遗传背景相同但产生VEGF能力明显不同的肿瘤细胞株,观察VEGF对细胞生长速率、体内成瘤及肿瘤生长和转移能力的影响。分别将来自高与低水平表达VEGF的肿瘤细胞和肿瘤组织的cDNA与含有16 361个人cDNA芯片杂交,分析差异表达基因及基因表达谱变化,并通过实时荧光定量PCR进行验证。结果:反义VEGF表达质粒可选择性抑制肿瘤细胞产生VEGF,VEGF产生减少并不影响肿瘤细胞在体外的生长速率和生长方式,但在小鼠体内生长明显变慢,转移减少。基因芯片杂交结果显示高与低水平表达VEGF的肿瘤细胞和肿瘤组织中存在82个共同的差异表达在2倍以上的基因。进一步从中选择出23个杂交信号强度较高(信号强度大于或等于40)的基因,根据cDNA芯片上的探针顺序,比对小鼠cDNA及EST数据库,在其中杂交信号强度较高(信号强度大于或等于40)的23个基因中,找到了17个同源基因,其中9个为功能已知基因。由于这些基因并非已知的新生血管形成有关的基因,提示可能有更多的新基因参与肿瘤新生血管形成。结论:VEGF通过调控肿瘤新生血管形成影响肿瘤的生长和转移,而VEGF的作用需要多个基因或信号通路构成的复杂网络来完成。

MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的制备及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

目的:构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒,制备MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白,研究该融合蛋白在肿瘤细胞内的定位及其对肿瘤细胞致凋亡作用。方法:PCR扩增MDA-7/IL-24基因,插入含有HaloTag(HT7)标签的载体中,构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒;MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白经IPTG诱导表达后纯化。利用带有荧光标记的HT7配基观察MDA-7/IL-24-HT7在肿瘤细胞内的定位。MTT法及AnnexinV-PI染色法检测MDA-7/IL-24-HT7对肿瘤细胞生长和凋亡的影响。结果:成功构建了表达MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的原核及真核表达质粒,MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白主要存在于E.coliBL21的包涵体内。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白定位于肿瘤细胞的内质网上。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞的生长,1mg/mlMDA-7/IL-24-HT7融合蛋白作用大肠癌HCT116细胞、肝癌SMMC7721细胞96h后,细胞凋亡率分别为(34.7±1.3)%和(22.1±0.9)%,显著高于未处理的肿瘤细胞(P<0.01)。结论:带有HaloTag标签的MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。

光子嫩肤术对大鼠皮肤胶原的影响

目的:研究光子嫩肤术(IPL)对大鼠皮肤Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及其基因表达的影响,探讨IPL的作用机理。方法:选择24只SD大鼠,每只背部皮肤选左右2个部位,右侧对照,左侧用强脉冲光照射,按实验时间段分成1周、2周、4周、8周四组,在照射后分别切取实验及对照部位皮肤作组织学观察,包括HE染色、Masson胶原染色;用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果:照射后1周、2周,两组皮肤的胶原含量无明显区别;照射4周、8周实验侧皮肤胶原纤维明显增多,同时,实验侧mRNA的表达在4周、8周均比对照侧增强(P<0.05)。结论:IPL能促进大鼠皮肤新生胶原的增生。

SiRNA和角膜新生血管

角膜病是一类严重的致盲眼病,而角膜新生血管(CNV)是角膜化学伤、外伤、感染等多种疾病的共同病理改变。导致CNV形成的原因仍不明确。血管内皮生长因子(VEGF)可能是CNV形成中最主要的血管形成因子。CNV的治疗方法包括药物、手术和激光等,但效果均不理想。RNA干扰技术给CNV机制研究和治疗带来新的思路。使用siRNA针对恰当的基因靶点产生沉默效应,是治疗CNV的潜在有效途径。