综合性医院教学能力评价指标体系构建

目的构建医院教学能力评价指标体系,建立医院教学管理模式,为客观评价医院教学提供研究工具,为规范医院教学管理提出政策性建议。方法采用问卷调查法、专家德尔菲法、层次分析法,建立医院教学能力评价指标体系和管理模式。结果医院教学能力评价指标主要包括教学意识、教学条件、教学管理、教学状态、教学结果等,其中人才培养、教学经费投入、教学人员设置、住院医师规范化培训、教学风气等子指标所占权重较大,表明其在教学工作中的重要性。结论为提高综合性医院的教学能力,医院应制定科学的教学人才培养目标、强化教学意识、增加教学投入、规范教学管理、加强师资队伍建设、加强教学手段创新。

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。

受人E2F1启动子调控的条件复制型腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体。方法以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT p-E1A酶切得到的E1A基因,插入线性化的pE2F1 p-EGFP,构建pE2F1 p-E1A;酶切重组质粒pE2F1 p-E1A产生受E2F1基因启动子调控E1A的完整表达框,插入质粒pDC311中,构建腺病毒包装穿梭质粒pDC311-E2F1 p-E1A,与腺病毒骨架质粒pBHGlox△1,3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制型腺病毒Ad-E2F1 p-E1A;扩增病毒并分别感染E2F1活性增强的系列肿瘤细胞株,利用病毒空斑形成实验检测重组条件复制型病毒的条件复制能力。结果限制性内切酶鉴定显示重组质粒构建成功,受人E2F1基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体仅在E2F1活性增强的肿瘤细胞株中实现条件性复制。结论构建的新型条件复制型腺病毒载体具有良好的选择性复制能力,在E2F1活性增强的肿瘤治疗方面有良好的应用前景。

微RNA-7在肿瘤中的生物学作用及其临床应用前景

微RNA-7(miR-7)是23个核苷酸长的非编码小分子RNA,其在多种肿瘤组织中的表达降低,与肿瘤生长、转移等密切相关。miR-7作为一个肿瘤抑制因子,可抑制表皮生长因子受体、胰岛素样生长因子1受体等基因的表达,从而抑制肿瘤的发生、发展。此外,miR-7还能提高肿瘤对化疗的敏感性,并抑制肿瘤血管生成。miR-7本身也受细胞内复杂机制的调控,其表达量变化及其对肿瘤的调控可为肿瘤的诊治提供新思路,具有良好的潜在临床应用前景。

条件复制型腺病毒的研究进展

条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd)基因治疗肿瘤的研究主要集中于提高其靶向性、增强肿瘤杀伤特异性,以及降低毒性作用三个方面。在提高CRAd靶向性的研究中,早期策略主要集中在腺病毒早期复制必需基因E1a/E1b突变或缺失的调控以及肿瘤或组织特异性启动子对其转录的调控;近年来利用组织特异性microRNA对病毒早期复制必需基因的转录后调控以及病毒外壳蛋白修饰的转导调控已逐渐成为研究的热点。在提高CRAd的肿瘤杀伤方面,除删除病毒自身凋亡抑制基因与导入外源性治疗基因两种方法以外,改造外壳纤毛提高病毒对靶细胞的亲嗜性及构建靶向肿瘤干细胞的CRAd成为新的关注点。同时,随着对腺病毒结构认识的逐步加深,修饰其外壳六邻体蛋白及其他外壳蛋白以降低CRAd的肝嗜性与免疫原性也正成为降低CRAd毒性作用的研究热点。

假基因对肿瘤生物学行为影响及机制的研究进展

假基因是一类与编码基因高度相似但不能表达功能蛋白质的细胞内非编码基因,曾一度被认为是"化石基因"。随着人们对假基因调节功能的不断认识,假基因在恶性肿瘤发生发展中的作用逐渐得到了重视。本文从假基因对恶性肿瘤细胞生物学行为的影响方面对近年来的研究进行了回顾。一般认为,假基因可以通过其转录产物影响同源或非同源的编码基因表达,并通过多种机制调节肿瘤细胞生物学行为。假基因是否有其它影响肿瘤生物学行为的机制还有待研究。

长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展

胰腺癌是一种恶性程度高、发展迅速、预后极差的恶性肿瘤,迄今为止除手术外尚无其他有效的治疗措施。因此,深入了解胰腺癌发生发展的分子机制,发现新的潜在治疗靶点尤为重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,在许多恶性肿瘤中发挥重要的调控作用,参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和远处转移等,在胰腺癌的诊断与治疗中有着广阔的临床应用前景。目前的研究发现,HOTAIR、MALAT1、H19等多种类型的lnc RNA在胰腺癌中存在表达异常的现象。

应用组织特异微RNA构建更加安全的腺病毒

溶瘤腺病毒是目前最有潜力的肿瘤治疗病毒载体之一,但其在应用过程中会产生比较严重的毒副作用,特别是肝脏毒性。为了更好地针对组织靶标,需要制备更加安全、有效的溶瘤腺病毒。近年来,科学家使用微RNA(miRNA)调控基因表达系统,将若干拷贝数的组织特异性miRNAs对应的靶序列加入到腺病毒复制早期必需基因E1基因表达盒的3'非翻译区,在转录后水平调控病毒复制。这种方法能有效消除腺病毒的毒副作用,进一步提高腺病毒使用的安全性。

Caspase-3基因表达调控研究进展

Caspase-3是细胞凋亡过程中发挥重要功能的凋亡执行蛋白之一。Caspase-3介导的非凋亡功能也倍受关注。Caspase-3发挥功能建立在酶原活化基础之上,因此,大量研究关注于caspase-3的活化过程。然而,越来越多证据显示caspase-3基因表达水平变化与诸多疾病过程密切相关。因此,就caspase-3基因表达调控相关研究进行综述,介绍caspase-3基因及5'-侧翼序列结构,并从表观遗传水平、转录水平、转录后microRNA作用、翻译水平等层面介绍caspase-3基因表达调控。

短发卡RNA稳定沉默FOXM1对肝癌细胞体外生长的影响

目的探讨短发夹RNA（short hairpinRNA，shRNA）表达载体稳定沉默叉头框M1（forkheadboxM1，FOXMl）基因对人肝癌细胞体外生长的影响。方法构建针对人类FOXMlmRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体，选择干扰效果最佳的表达载体和阴性对照质粒转染人肝癌细胞QGY-7703，用新霉素（G418）筛选稳定转染的克隆。用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和平板克隆形成实验检测FOXMl基因沉默前后肝癌细胞体外生长能力的变化。用AnnexinV—APC／PI双染法检测细胞凋亡。结果不同人肝癌细胞株中普遍表达FOXM1蛋白。4个shRNA表达载体中，shRNA-1026表达载体的干扰效果最佳，对FOXM1mRNA和蛋白表达水平的抑制率分别为38．5％和53．2％。用shRNA-1026稳定沉默FOXM1基因后，QGY-7703细胞增殖受到抑制，培养48、72和96h后，沉默组的吸光值均显著低于对照组（分别t=10．830，3．578，5．734，均P〈0．05）；沉默组的克隆形成能力较对照组显著降低（t：5．336，P〈0．05），而细胞凋亡较对照组显著增加（t=6．827，P〈0．05）。结论shRNA表达载体稳定沉默FOXM1基因抑制肝癌细胞的生长。

超声辐照微泡增强病毒载体转染的细胞内吞行为研究

目的探索超声辐照微泡介导腺相关病毒（AAV）对不同细胞的转染和细胞内吞活动。方法以不同梯度浓度的携增强型绿色荧光基因的重组腺相关病毒2型（rAAV2-EGFP）转染人宫颈癌细胞（HeLa）和小鼠成纤维细胞（NIH／3T3）细胞，分别获得最佳可提高基础浓度。以此浓度，超声辐照微泡介导rAAV2-EGFP转染HeLa和NIH／3T3细胞后48h荧光显微镜观察和流式细胞仪检测EGFP基因转染效率，并采用CCK-8检测其安全性。超声辐照微泡介导AAV转染后45min，采用免疫荧光的方法共聚焦显微镜和透射电镜观察细胞膜内网格蛋白包裹的内吞泡的数量和分布。结果rAAV2-EGFP转染HeLa和NIH／3T3细胞的最佳可提高浓度分别为2000v．g．／cell和10000v．g．／cell。超声辐照微泡可显著提高rAAV2-EGFP对HeLa和NIH／3T3细胞的转染效率（P〈0．01），而细胞活性无显著下降（P〉0．05）。共聚焦显微镜和电镜显示，超声辐照微泡介导后，细胞膜内侧面网格蛋白包裹的内吞泡明显增多。结论超声辐照微泡可提高有赖于细胞转运的AAV病毒颗粒对两种不同细胞的基因转染，激活细胞内吞活动可能是超声辐照微泡促进AAV转运的机制之一。

环形RNA研究进展

环形RNA(circular RNA,circ RNA)广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征。目前认为,circ RNA可以在转录后水平调控基因表达,但是circ RNA的产生机制及其代谢途径仍然不是很清楚。迄今研究认为,circ RNA的主要生物学作用是作为微小RNA(micro RNA,miRNA)海绵体调控miRNA的表达。此外,circ RNA在肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病、帕金森病等多种疾病的发生发展中发挥了一定的作用。深入了解circ RNA的作用机制及其功能,有助于深入了解疾病的发生、发展机理,设计更好的预防、诊断和治疗疾病新策略。

胃癌细胞中Ras基因的表达、突变分析及新剪接型Kras△E2的发现

目的:传统Ras家族由Kras,Hras和Nras基因组成,这类基因的点突变经常在人类肿瘤中发现,突变热点位于12,13,61位密码子。ERas基因是2003年在鼠胚胎干(ES)细胞中发现的,其cDNA编码的蛋白与Kras,Hras和Nras分别有46%,43%和47%的相似性,故属于新的Ras家族成员,近几年发现ERas基因的表达与胃癌密切相关,而传统Ras基因在胃癌细胞中的表达及突变情况系统报道较少,本文旨在研究传统Ras基因Kras,Hras,Nras及其家族新成员ERas基因在胃癌细胞中的表达和突变情况。方法:选用7株不同来源不同分化程度的胃癌细胞系,利用RT-PCR及real-timePCR检测Ras基因在这些胃癌细胞系中的表达,并通过测序对传统Ras基因突变热点12,13,61位密码子及ERas基因全长进行突变分析。结果:①Ras基因在这些胃癌细胞系中均有不同程度的表达,其中Hras和Nras基因在各株细胞中表达水平均一,而Kras和ERas基因则呈差异性表达;②在这些胃癌细胞中传统Ras基因突变热点12,13,61位密码子不存在突变,ERas基因全长亦未检测到突变.③发现Kras基因一新的剪接型,特点为第一、三外显子直接拼接,缺失第二外显子,命名为Kras△E2。结论:与在其他肿瘤中不同,传统Ras基因在胃癌细胞中不存在突变热点,家族新成员ERas基因全长亦无突变,在国际上首次报道新剪接型Kras△E2,从而得出创新性结论:Ras基因家族在胃癌细胞中并不是通过热点突变导致持续活化而致癌,而可能是通过ERas基因表达量的调节或形成新的剪接型Kras△E2而致癌。另外,Kras基因是一被受国际关注的肿瘤基因,新剪接型的发现可能会对Kras基因致癌机制产生新的认识,意义重大。

人胰腺癌细胞再增殖体外模型的建立

目的:细胞再增殖是导致胰腺癌放化疗失败的主要原因之一,但缺乏合适的用于研究胰腺癌再增殖的细胞模型。本研究拟建立简便、实用的胰腺癌细胞再增殖体外模型。方法:表达绿色荧光蛋白-荧光素酶(GFP-Luc)的慢病毒感染人胰腺癌细胞,经嘌呤霉素筛选,用荧光显微镜和流式细胞仪观察双标记细胞GFP表达情况,用生物成像检测双标记细胞Luc活性及分析细胞数量与Luc活性之间的关系。以X-线照射胰腺癌细胞制备饲养细胞,以相应的双标记肿瘤细胞为报告细胞进行共培养。对共培养细胞进行荧光显微镜观察和生物成像,以判断饲养细胞对报告细胞的生长促进作用。结果:通过表达GFP-Luc的慢病毒感染获得双标记人胰腺癌细胞,经荧光显微术、流式细胞术和生物成像术证实这些双标记的人胰腺癌细胞能有效地表达GFP和Luc活性,可作为报告细胞用于建立人胰腺癌再增殖细胞模型。将经X-线照射的饲养细胞和相应的报告细胞共培养,经荧光显微镜观察和生物成像分析,结果显示X-线照射过的饲养细胞对报告细胞的生长具有显著的促进作用。结论:成功建立了简便、实用的人胰腺癌再增殖体外模型,该模型能很好地模拟人体内胰腺癌细胞再增殖过程,为进一步研究胰腺癌细胞再增殖的分子机制提供了新的技术手段。

构建一种受hTERT启动子和miR-145双调控的更为安全的新型溶瘤腺病毒

目的:构建一种受人端粒酶逆转录酶(h TERT)启动子和mi R-145双调控的更加安全的条件复制型腺病毒。方法:在已构建的h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的条件复制型腺病毒Adzq11基础上,再将四个拷贝的mi R-145的靶序列加入到E1A的3'非翻译区,构建新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T。应用Real-time PCR测定人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HLF中mi R-145的表达量;然后在这两株细胞中,分别转染Adzq11和Adzq11-145T对应的穿梭质粒及感染病毒本身,用Real-time PCR检测E1A表达量以测定调控效果;用病毒空斑单位法检测两种病毒的复制情况;用CCK8检测对A549和HLF细胞的杀伤作用。结果:构建的新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T在HLF中复制量明显低于Adzq11,其E1A m RNA水平和杀伤效应也显著降低。而在A549中,Adzq11-145T在E1A表达、病毒复制和溶瘤能力方面较Adzq11均无显著降低。结论:成功构建出一种新的受转录和转录后水平双重调控的条件复制型腺病毒Adzq11-145T,它比仅加入h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的腺病毒Adzq11更加安全。

Neuronatin对人视网膜色素上皮细胞增殖迁移的影响

目的:研究胚胎时期表达部位广泛、丰度高,而成年后分化表达的印记基因Neuronatin(Nnat)的两种剪接形式Nnatα和Nnatβ对人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖、迁移的影响。方法:构建Nnatα、β两种剪接形式的表达质粒,转染RPE获得表达该基因的稳定表达细胞株;CCK-8实验检测稳定表达细胞株的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,细胞划痕实验检测其迁移能力。结果:成功构建了Nnatα和Nnatβ表达质粒,并获得了Nnatα和Nnatβ基因稳定表达PRE细胞株。CCK-8实验结果显示cNNATα组与对照组相比较,增值率为23.33%(P<0.05),cNNATβ组相较于对照组无显著性差异,细胞周期分析cNNATα组和cNNATβ组细胞在G2-S期的百分率分别为18.60%、11.11%,对照组细胞的为9.94%;相较于对照组,cNNATα组的细胞迁移能力显著增强,cNNATβ组的细胞迁移能力微弱增强。结论:Nnatα对RPE有一定的增殖作用,其影响主要在S期;同时,Nnatα显著促进RPE细胞的迁移能力。

Neuronatin在人体常见肿瘤中的表达及对肿瘤细胞增殖的影响

目的:研究印记基因Neuronatin(NNAT)在人体常见肿瘤中的表达情况及其两种编码产物NNATα和NNATβ对肿瘤细胞增殖的影响。方法:运用组织芯片免疫组化技术对一些人体常见肿瘤及其对应正常组织中NNAT的表达进行系统检测;同时利用腺病毒载体技术,将NNATα和NNATβ分别导入人结肠癌细胞系SW620,并用实时细胞分析仪和平板克隆实验分析细胞增殖能力的变化。结果:①免疫组化结果显示:NNAT在食道鳞癌,结肠腺癌,直肠腺癌,胰腺腺癌,乳腺非特殊性浸润性导管癌,宫颈鳞癌,子宫内膜癌,膀胱移行上皮癌,肺鳞癌,皮肤鳞癌以及前列腺腺癌11种肿瘤组织,肾上腺,皮肤,睾丸,脑,骨骼肌,胰腺6种正常人体组织,以及慢性结肠黏膜炎与慢性肝炎2种炎性组织中呈阳性。②体外细胞增殖实验结果显示,NNATα对人结肠癌肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。结论:NNAT基因在多种人体肿瘤组织中表达,其α片段的表达对于结肠癌细胞系SW620增殖具有轻微抑制作用。

ERas基因在胃癌中的表达及其作用机制的研究进展

胚胎干细胞(ES cells)为多能干细胞,来自哺乳动物胚胎早期。ES细胞表达的Ras(ERas)基因促进其体外增殖和肿瘤形成。该基因产物Ras蛋白关联和激活多个下游效应,调控多种细胞反应来参与细胞增殖,存活与分化。ERas基因位于X染色体短臂(Xp11.23),其cDNA编码的蛋白包含227个氨基酸,与传统ras基因Hras,Kras和Nras分别有43%,46%和47%的相似性,故属于新的ras家族成员,与传统ras基因不同的是ERas基因非常活跃但不带有任何突变。近几年发现ERas基因的表达与胃癌密切相关,本文就ERas基因在人胃癌细胞和组织中的表达及其机制的最新进展做一综述,主要包括三个方面:1,ERas基因在胃癌细胞和组织中的表达情况及其功能。2,ERas基因在胃癌细胞中的表观遗传调控。3,ERas基因与胃癌肝和淋巴结转移的关系。

竞争性内源RNA调控肿瘤进程的研究进展

蛋白编码转录组和假基因、长链非编码RNA和环形RNA等非编码转录组共同组成了竞争性内源RNA（ceRNA）.ceRNA之间通过miRNA应答元件进行“对话”,竞争性结合miRNA,调节基因的转录后表达.越来越多的研究发现,ceRNA通过拮抗效应隔离miRNA,形成一个广泛的基因转录后调节网络,参与正常生理状态的维持及对肿瘤等疾病的发生、发展过程的调控.ceRNA对肿瘤进程的调控可分为正性调控及负性调控,结果因其所影响的miRNA种类及细胞类型而异.ceRNA对肿瘤进程的调控作用使其可能成为肿瘤临床诊治的新靶点。