E2F3a在U251胶质瘤细胞中的功能研究

背景与目的:E2F3a是一种重要的转录激活因子,在多种肿瘤组织中均呈现表达上调。E2F3a在恶性化程度较高的神经胶质瘤中表达较高,目前它在胶质瘤细胞中的功能尚不清楚。本文的目的是研究E2F3a对U251胶质瘤细胞周期和凋亡的影响。方法:通过脂质体介导质粒转染在U251细胞中过表达E2F3a;用Western blotting检测细胞内E2F3a蛋白质的表达水平;用PI-核DNA染色结合流式细胞术分析细胞周期分布;用Annexin V-PE和7-AAD染色结合流式细胞术分析细胞凋亡比例;用实时荧光定量PCR方法测定细胞内A2、B1、D1和E细胞周期素mRNA的相对表达水平。结果:与空载体转染对照组相比,E2F3a过表达可将位于S期的细胞比例提高28%(P<0.01),将位于G0/G1期和G2/M的细胞比例分别降低15%和13%(P<0.01)。E2F3a过表达对细胞凋亡无明显影响。进一步研究发现,E2F3a可显著上调细胞周期素D1和E的mRNA表达,而不影响周期素A2和B1的mRNA表达。结论:E2F3a是胶质瘤细胞增殖的促进因子,它可通过上调细胞周期素D1和E的表达加速细胞由G1期进入S期。

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

原钙粘蛋白分子与神经元的多样性

大脑是人体内结构和功能最为复杂的器官,它实现人类的感知、情感、思维、记忆并控制其他器官的活动。神经元是大脑结构的基本单元,大约1000亿个神经元通过神经突起相互连接组成复杂而有序的神经网络。神经元是多种多样的,神经元的多样性决定了大脑处理储存信息的容量。科学家们发现神经元的多样性与一种膜蛋白分子-原钙粘蛋白的分子多样性有关,不同原钙粘蛋白分子在神经元内随机组合表达赋予每个神经元自己的个性。

O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)是催化N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)结合到蛋白质Ser或Thr上的糖基转移酶,是黏蛋白型O-糖基化修饰的起始糖基转移酶。ppGalNAc-T是一个酶家族,表达产物均为Ⅱ型膜蛋白。虽然氨基酸序列高度同源,但各成员具有独特的底物特异性和动力学特征。因此,ppGalNAc-T的底物作用机制是O-糖基化研究领域中的关键课题。近年来,通过利用定点突变及晶体结构解析技术,ppGalNAc-T中与底物相互作用的重要氨基酸残基以及由这些残基所形成的对底物结合起关键作用的空间构象逐渐被揭示,为了解ppGalNAc-T酶家族的底物作用机制及其蛋白结构与催化活性间的关系提供了理论依据。

雌二醇对小鼠小脑颗粒细胞轴突生长、体外增殖和迁移的影响

雌激素在小脑的发育过程中发挥着重要的生物学作用.就雌二醇对体外培养7日龄小鼠小脑颗粒细胞的增殖、迁移和轴突生长的影响进行了研究.结果表明:雌二醇可将小脑颗粒细胞的增殖和迁移活性提高一倍以上,雌二醇存在的条件下轴突在48 h内的长度较对照组长0.5倍左右(P<0.001),这对揭示脑部的雌激素对正常小脑发育过程中的作用具有重要意义.

基于质谱的蛋白质O-糖基化分析

蛋白质的O-糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它和N-糖基化一样是蛋白质糖基化修饰的主要形式。蛋白质的O-糖基化对蛋白质的结构功能有重要的影响,因此分析蛋白质的O-糖基化具有重要的生物学意义。蛋白质O-糖基化分析包含4个方面的内容:(1)鉴定O-糖基化蛋白质的种类;(2)鉴定糖基化位点;(3)鉴定糖链结构;(4)糖链的定量分析。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列,缺乏通用的糖苷酶以及O-糖链结构的复杂性等原因,基于质谱的蛋白质O-糖基化的分析目前仍处于方法开发阶段。本文主要介绍基于质谱的O-糖基化蛋白质的分析方法学在近期取得的一些进展,包括以下4个方面:O-糖蛋白/多肽的富集、O-糖链的解离、O-糖链的结构分析及O-糖基化定量分析。

重组PLZF蛋白锌指结构域的表达、提纯和活性分析

PLZF(promyelocytic leukaemia zinc finger protein)是一种重要的转录抑制因子,它由位于N端的BTB结构域和C端的锌指结构域构成。鉴于目前对于锌指结构域的立体结构还不是十分清楚,对其进行了高效表达和提纯。为了表达PLZF蛋白的锌指结构域,在其编码序列的5'端加上起始密码ATG后插入到表达载体PET-11a的多克隆位点。构建好的表达质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌内并用IPTG诱导表达,发现重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式在胞内表达。用含有SDS变性剂的缓冲液溶解包涵体后,采用凝胶过滤方法将重组蛋白纯化到纯度达96%以上。对纯化后的蛋白质用反透析的方法进行复性,然后用DNA结合实验进行活性分析,发现复性后的蛋白质具有特异的DNA结合活性,这为进一步研究PLZF蛋白锌指结构域的立体结构打下了重要基础。