MACS检测胃癌腹腔冲洗液游离癌细胞的研究

目的探讨胃癌腹腔微转移情况的检测方法及意义。方法手术中切除肿瘤前收集腹腔冲洗液,采用磁激活细胞分离术(MACS)对不同病理分期胃癌患者腹腔冲洗液中癌细胞进行富集并检测。分别标记带磁珠的细胞角蛋白(CK)抗体,经磁柱富集CK+上皮细胞,用流式细胞仪检测其含量,并比较胃癌组与胃平滑肌瘤组(对照组)以及胃癌不同分期之间、磁富集前后CK+上皮细胞含量的差异。结果在未经MACS富集的标本中较少发现CK+CD45-细胞;在富集后的标本中其含量在胃癌组与对照组有显著差异(41/50,1/10,P<0.001);pTNMⅠ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期之间(0.67%,3.42%,P<0.001)差异有非常显著性。结论MACS能有效地富集上皮来源细胞,提高上皮源细胞的检出率,并能反映腹腔游离癌细胞数量;上皮细胞数量与胃癌的存在及临床病理分期有关,其有利于判断肿瘤转移和预后并指导治疗。

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人肝癌细胞HepG2凋亡与TGF—β1-Smad通路激活有关

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对人肝癌细胞HepG2细胞周期和凋亡的影响及其机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测EGCG对HepG2细胞增殖的影响，流式细胞术检测EGCG对HepG2细胞周期的影响以及细胞凋亡情况，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和萤光素酶报告基因系统检测验证HepG2细胞中TGF—β1-Smad通路的完整性，实时聚合酶链反应（realtime PCR）检测EGCG对HepG2细胞中Sfnad2、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA表达的影响。结果高浓度EGCG干预时，HepG2细胞的增殖能力随着EGCG浓度和作用时间的增加而下降，呈明显的时效和量效关系，作用72h，HepG2细胞的IC50为111．76μmoL／L。随EGCG剂量增大，HepG2细胞中G0／G1期细胞的比例逐渐增高，80、120和160μmoL/L EGCG处理组分别为44．9％、54．8％和91．3％；相反，S期细胞比例逐渐降低，80、120和160μmoL/L EGCG处理组依次为38．5％、29．2％和3．0％。随着EGCG剂量增大，HepG2细胞的早期凋亡增加，80、120和160μmol／L EGCG处理组的早期凋亡率分别为1．82％、4．22％和6．83％；晚期凋亡也随之增加，80、120和160μmol／L EGCG处理组的晚期凋亡率分别为7．92％、24．19％和27．92％。HepG2细胞中TGF—β1-Smad通路是完整的。EGCG对HepG2细胞中Smad2、Smad3和Smad4 mRNA的表达无明显影响，但下调Smad7 mRNA的表达。结论EGCG能诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡，其机制可能涉及TGF—β1-Smad通路的激活。

携带mda-基因的复制缺陷型腺病毒通过促进线粒体释放促凋亡蛋白杀伤肝癌细胞

目的探讨黑色素瘤分化相关基因7／白介素24（mda-7／IL-24）基因选择性杀伤肝癌细胞的机制。方法应用携带mda-7基因的复制缺陷型腺病毒Ad．mda-7感染正常肝细胞l02和肝癌细胞HepG2。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附实验（ELISA）及Westernblot方法，观察mda-7／IL-24基因的表达；应用Hoechst染色和流式细胞仪观察mda-7／IL-24对肝癌细胞的杀伤作用；采用RT—PCR和Westemblot方法，观察Bcl-2家族和caspase-9基因表达的变化，分离不同感染时点细胞内线粒体和胞浆蛋白，并检测线粒体释放促凋亡蛋白细胞色素C（Cyt-C）和Smac／DIABLO的变化过程。结果Ad．mda-7能介导mda-7／IL-24在两种细胞株中的高效表达。能选择性杀伤肝癌细胞，感染24h后，HepG2细胞凋亡率为24．0％±4．6％，而对正常的肝细胞没有影响。RT—PCR和亚细胞蛋白的分析结果显示，胞浆内Bcl-2和Bcl-xL的表达在HepG2细胞中明显下降，而在1-02细胞中的表达无变化，Bax在肝癌细胞中的表达明显增强，Bak的表达无变化；Ad．mda-7能促进细胞线粒体释放Cyt-C和Smac／DIABLO蛋白，并促进caspase-9的表达。结论Ad．mda-7能选择性杀伤肝癌细胞HepG2，通过促进线粒体促凋亡蛋白的释放而诱导肝癌细胞凋亡。

黑色素瘤分化相关基因-7和白介素-24选择性杀伤肝癌细胞和诱导增殖阻滞的体外研究

目的探讨黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24基因(mda-7/IL-24)对不同种类肝癌细胞的选择性杀伤作用。方法将携带人 mda-7/IL-24基因的复制缺陷型腺病毒(Ad.mda-7)感染人正常肝细胞和各种肝癌细胞,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附(ELISA)实验观察mda-7/IL-24基因的表达,MTT 法观察肝癌细胞的生长抑制,Hoechst 染色及 Annexin-V 和 PI 双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况及用流式细胞仪检测细胞周期。结果 RT-PCR 和 ELISA 提示Ad.mda-7能介导外源基因 mda-7/IL-24在各种肝癌细胞株和正常肝细胞中高效表达。MTT 实验结果提示 mda-7/IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长,Hoechst 染色和流式细胞仪检测提示 mda-7/IL-24能选择性杀伤肝癌细胞,细胞周期分析提示 mda-7/IL-24阻滞肝癌细胞在 G2/M 期,同时对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用。结论 mda-7/IL-24基因能选择性杀伤各种肝癌细胞,促进细胞增殖阻滞及诱导细胞凋亡。

Ad．mda-7高选择性杀伤不同转移潜能肝癌细胞的研究

目的利用携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda7）作为载体，感染不同转移潜能的肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用和增殖抑制作用。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染正常肝细胞L02和肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L和Hep3B，通过RT-PCR和ELISA方法观察MDA7基因的表达，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTT）观察该基因对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和流式细胞仪观察MDA-7对肝癌细胞的杀伤作用，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常细胞L02中高效表达；ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，而且随着感染时间延长表达量升高；MTT实验结果表明MDA7能明显抑制肝癌细胞的生长，Hoechst染色和流式细胞仪提示MDA7能促进肝癌细的凋亡；细胞周期检测提示肝癌细胞大量被阻滞在G2／M期，正常细胞没有增殖阻滞作用。各项结果提示MDA7对正常的肝细胞没有促进凋亡和增殖阻滞的作用。结论Ad．mda-7选择性的杀伤肝癌细胞，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡与肝癌细胞的转移潜能无关。