儿童专科医院特色生物样本库的建立与应用

生物样本库是一种集中收集、处理、存储和应用各种生物材料及其相关信息用于疾病的临床诊疗研究的生物应用系统（[1]）。一般由两部分组成：一是样本实体库,即可以从中提取到DNA、RNA、蛋白质等成分的组织或血液等生物样本;二是样本信息库,包括从生物样本中提取DNA、RNA、蛋白质等成分所得到的个人独有的遗传信息数据及临床诊疗信息（[2]）。

人类资源库生物安全概要及自检表单

根据经济合作与发展组织(OECD)的定义,“生物样本库是一种集中保存各种人类生物材料,用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统”^([1])。

成人与儿童急性髓系白血病患者肿瘤免疫相关的差异表达基因分析

目的·分析成人与儿童急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓中肿瘤免疫相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。方法·从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库下载GSE134589数据集,选取初次确诊/复发状态的患者,按年龄分为儿童组(0~16岁,34例)、中青年组(17~59岁,62例)和老年组(60~80岁,62例),用R语言程序包筛选不同组患者骨髓样本中肿瘤免疫相关的DEGs。选取中青年组与儿童组,老年组与儿童组共同的DEGs,与完全缓解状态的成人与儿童患者的DEGs进行比对,并进行功能富集分析。利用Kaplan-Meier法筛选与预后显著相关的基因,通过构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络筛选核心调控基因,将以上2种方法筛选出的基因视为关键基因。用GEPIA服务器对比关键基因在AML、弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)和胸腺癌的肿瘤样本与正常人样本的表达量,在GEXC网站分析关键基因在AML患者肿瘤干细胞和健康人的原始造血细胞中mRNA的表达情况。结果·GSE134589数据集中,中青年组与儿童组比,上调的DEGs有51个,下调的有21个;老年组与儿童组比,上调的DEGs有47个,下调的有20个;而中青年组与老年组比,没有发现DEG。筛选了中青年组和老年组共同的肿瘤免疫相关DEGs 57个,其中上调有39个,下调有18个,仅有3个基因的表达水平差异在疾病完全缓解时仍有统计学意义。57个共同DEGs主要富集在白细胞迁移和细胞因子介导的信号通路,其中白细胞介素2受体α亚基(interleukin-2 receptor subunit alpha,IL2RA)、FMS-样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)高表达的患者与低表达的患者相比总体生存期显著缩短(均P<0.05),补体成分3a受体1(complement component 3a receptor 1,C3AR1)是PPI网络的核心调控基因。这3个基因作为关键基因,均在AML肿瘤样本特异性高表达(均P<0.05),IL2RA还在DLBCL患者样本中显著高表达(P<0.05)。IL2RA在AML肿瘤干细胞和健康人的原始造血细胞中均低表达,FLT3均高表达,而C3AR1的表达在AML肿瘤干细胞特异性升高。结论·成人与儿童AML患者预后的差异可能与骨髓中肿瘤免疫相关基因表达的差异有关,其中IL2RA、FLT3和C3AR1可能是发挥重要作用的关键基因。

利用人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化模型建立体外神经毒性测试的实验研究(英文)

目的许多药物具有神经毒性,尤其是对于儿童的影响更大。目前常用的药物体内毒性实验既耗时又昂贵。人胚胎干细胞和人羊水干细胞的神经分化有望建立一种理想的用于评价药物神经毒性的体外评估系统。此项研究旨在利用红藻氨酸的神经毒性验证此系统的可行性。方法单层贴壁状态下,人胚胎干细胞和人羊水干细胞在化学成分明确的诱导条件下向神经细胞诱导。这些细胞经神经细胞特异性的抗体染色证实其特性。诱导得到的神经细胞在不同浓度红藻氨酸的培养液中进行培养和扩增,每代细胞进行计数,绘制细胞的生长曲线。结果人胚胎干细胞和人羊水干细胞均可被高效地诱导为神经细胞;人胚胎干细胞的神经诱导效率高于人羊水干细胞;红藻氨酸对诱导得到的神经细胞具有毒性,其浓度与毒性呈正相关。结论人胚胎干细胞和人羊水干细胞的体外神经分化可作为用于评价药物神经毒性的体外评估系统。

脊髓A1型星形胶质细胞在外周炎性痛中的动态变化

目的研究外周炎性痛小鼠痛行为以及脊髓A1型星形胶质细胞的动态变化,为阐明炎性痛的病理机制提供实验基础及理论依据。方法雄性C57BL/6小鼠16只,分为对照组8只和炎性痛组8只。小鼠右侧足底注射完全弗氏佐剂(CFA)建立外周炎性痛模型,对照组右侧足底注射相同体积生理盐水。在造模前以及造模后第1、3、5、7天检测小鼠机械刺激缩足阈值(MWT)和辐射热刺激缩爪潜伏期(PWL)的变化。以逆转录聚合酶链反应检测A1、A2型星形胶质细胞标志物在炎性痛不同时程脊髓内的动态表达变化。用免疫荧光法检测小鼠脊髓背角GFAP形态以明确星形胶质细胞激活,同时统计脊髓背角A1型星形胶质细胞标志物C3与GFAP共定位水平。结果炎性痛小鼠造模后患侧MWT、PWL均明显下降,小鼠出现机械性痛觉超敏与热痛觉过敏;且在造模后第3天,脊髓背角GFAP表达开始升高,表达量为1.84±0.10 vs 1.08±0.22(P<0.05);炎性痛第7天,A1型星形胶质细胞标志物Serping1、H2-T23的mRNA水平均显著升高(P<0.05),A2型星形胶质细胞标志物S100a10、Ptx3的mRNA水平降低(P<0.05);炎性痛组小鼠脊髓背角星形胶质细胞内C3的表达增加(P<0.05)。结论炎性痛小鼠脊髓反应性星形胶质细胞向A1型极化增加,提示A1型星形胶质细胞可能参与了炎性痛的发生发展。

脓毒症及脓毒性休克患儿的免疫功能变化的研究

目的:探讨脓毒症及脓毒性休克患儿各免疫指标的变化以及对疾病预后的影响。方法:18例脓毒症及36例严重脓毒症患儿于发病3d、7d分别检测T淋巴细胞亚群(CD3+,CD4+,CD8+,CD19+)和IgG、IgA、IgM,同时记录生命体征的变化和预后转归,其中死亡病例5例归入死亡组。同期19名健康体检儿童为健康对照组。结果:脓毒症组发病3d内的CD4+、CD19+T淋巴细胞亚群计数较正常组和严重脓毒症组明显升高,两组比较有统计学意义(P<0.05)。IgG、IgA、IgM在发病3d内各组水平比较无统计学意义。发病7d复测T淋巴细胞亚群和体液免疫功能,死亡组CD3+、CD4+、CD8+、IgG、IgA均明显低于存活组,差值比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:脓毒症的免疫状态在疾病的不同阶段表现不同,随着病情进展免疫抑制状态持续并恶化预示了疾病预后不良。

人诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化及其应用于临床治疗的研究进展

视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞是位于视网膜最外层的单层细胞,呈六角形,胞内富含黑色素。其功能主要包括：（1）吞噬感光细胞外节段;（2）代谢视紫红质;（3）参与构成血-视网膜屏障;（4）合成黑色素等。RPE细胞的功能丧失会引起多种视网膜疾病,如年龄相关黄斑变性、Stargardt病等[1]。RPE细胞已经到达终末分化阶段,损伤后无法再生,

cGAS-cGAMP-STING信号通路在神经系统疾病中的研究进展

胞质病原体 DNA 或是线粒体 DNA 均可作为免疫原分子激活细胞的固有免疫反应。位于细胞内的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),如 ZBP1(Z-DNA-binding protein 1)和 AIM2(absent in melanoma 2)等可识别哺乳动物细胞内的胞质 DNA[1]。

MLPA-微阵列技术在Y染色体异常检测中的初步应用

为了探讨MLPA-微阵列技术用于检测性染色体异常的可行性和精确性,针对Y染色体上的3个基因TSPY(p11.2)、PRY(q11)和RBMY(q11.2)设计MLPA探针,应用MLPA-微阵列技术对15例已知染色体核型的样品进行检测,将检测结果与各样品核型分析和PCR的检测结果进行对照和比较。结果表明,MLPA-微阵列技术对上述各基因位点的检测结果与样品染色体核型基本吻合,特别是对二例核型分析没有获得染色体结构异常信息的样品,MLPA-微阵列技术检测出Y染色体微小的缺失或指示某些未知染色体片段的信息,并与PCR检测结果完全相符。表明文章报道的MLPA-微阵列技术能够检测核型分析无法分辨的微小变化和异常,显示MLPA-微阵列技术在染色体异常分析中具有很高的检测效率和准确性,相对于染色体核型分析具有明显的优势,在临床染色体病诊断中具有较大的应用前景。

egr-1在学习记忆中的作用及机制研究进展

学习和记忆是大脑对外界有关信息获取、处理、存储和提取的过程,其所依赖的生物学基础是神经元之间通过突触相互连接形成复杂的神经网络,启动一系列生化级联反应,导致突触可塑性变化,如长时程增强（long term potential,LTP）和长时程抑制（long term depression,LTD）,其中,LTP与学习记忆的关系尤为密切。

隐睾和尿道下裂患儿尿源性细胞的培养和鉴定

目的体外培养健康人及隐睾和尿道下裂患儿尿源性细胞并对其生物学特性进行鉴定。方法分别收集健康人、隐睾和尿道下裂患儿的清洁尿液，离心后收集沉渣，接种培养，连续传代。对培养得到的细胞进行细胞免疫荧光染色、核型分析、短串连重复序列分析等实验鉴定其生物学特性。结果倒置相差显微镜下观察细胞的生长，细胞在体外培养条件下增殖旺盛，根据其传代时的细胞数绘制的生长曲线显示：隐睾和尿道下裂患儿的尿液来源的细胞与健康人尿液来源的细胞具有相似的体外增殖能力；细胞免疫荧光染色显示：尿源性细胞表达尿道上皮细胞表面标志物；这些细胞均保持正常的核型；短串连重复序列实验表明：这些细胞分别具有自身独特的基因座，其DNA分型在ATCC、JCRB、DSMZ细胞库中均未找到与其细胞分型100％相匹配的细胞。结论无论是健康人还是疾病患儿的尿液中均能培养出大量细胞，这些细胞以上皮细胞为主；这些细胞核型正常，携带有相应个体独一无二的遗传信息，可作为简便无创的细胞来源，为研究个体特异的、疾病特异的机制研究和临床诊断提供来源。

E-钙黏蛋白在神经母细胞瘤上皮-间质转化中的作用

目的研究神经母细胞瘤中E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达在肿瘤转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的上皮-间质转化(EMT)中的作用。方法体外采用TGF-β1(1μg/L、5μg/L、10μg/L)处理人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,与空白对照组比较,采用荧光定量PCR及Western blot法检测EMT相关基因及蛋白表达。采用迁移实验及划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力的改变。选取2008年1月至2012年12月上海交通大学附属儿童医院血液肿瘤科收治的神经母细胞瘤患儿18例。收集患儿术后肿瘤组织,采用免疫组织化学法检测E-cadherin的表达情况,并与患儿临床特点及生存预后行相关性分析。结果与空白对照组相比,SK-N-SH细胞经TGF-β1(1μg/L、5μg/L、10μg/L)处理后,实时荧光定量PCR及Western blot均提示上皮细胞标志E-cadherin的mRNA(0.603±0.081、0.606±0.008、0.716±0.166比1.000)及蛋白(0.855±0.026、0.600±0.017、0.495±0.011比1.000)表达量明显下降(F=8.144,P=0.035;F=74.810,P<0.001),间质细胞标志α-平滑肌肌动蛋白的mRNA(2.132±0.167、3.494±0.017、4.184±0.021比1.000)及蛋白(1.175±0.053、1.189±0.058、1.225±0.106比1.000)的表达量明显上升(F=547.300,P<0.001;F=68.810,P=0.007),提示发生EMT。划痕实验及Transwell迁移实验均发现随着TGF-β1处理后(5μg/L),迁移细胞数明显增多(t=16.070,P=0.040)。神经母细胞瘤患儿组织病理中E-cadherin强阳性、阳性、弱阳性及阴性表达的10年总体生存(OS)率分别为(77.78±13.86)%、(75.00±21.66)%、(25.00±21.65)%及0,差异有统计学意义(F=8.160,P=0.040)。结论TGF-β1可诱导神经母细胞瘤SK-N-SH细胞发生EMT,并使细胞迁移能力增强。神经母细胞瘤患儿E-cadherin表达降低与疾病临床进展及复发/转移明显相关。

ES细胞和iPS细胞体外向雄性生殖细胞分化的研究进展及其对研究隐睾性不育的意义

1994年在埃及召开的国际人口与发展大会上提出了2015年人人享有生殖健康的宏伟目标。毫无疑问，生殖健康是健康的核心，维护与促进生殖健康是人类社会进步与发展的支柱、动力和保证。小儿外科的发展，除了临床技术的提高，也需要在疾病的机制方面开展研究，利用新的基础研究手段开展转化型研究，将有助于小儿外科在更高的层次上长期发展。

人隐睾特异性诱导多能性干细胞体外向生殖细胞定向分化的初步研究

目的 将人隐睾特异性诱导多能性干细胞在体外定向分化形成生殖细胞.方法 将人隐睾特异性诱导多能性干细胞在去除饲养层细胞的条件下进行贴壁培养,诱导液中加入BMP4因子,诱导的不同阶段收集分化后的细胞进行细胞免疫染色和生殖细胞特异基因表达的检测.结果 人隐睾特异性诱导多能性干细胞在体外可分化形成DAZL阳性细胞,加入BMP4诱导分化的细胞中,DAZL阳性细胞数明显高于未加入BMP4的细胞,但没有观察到SCP3阳性细胞;加入BMP4诱导分化后的细胞DAZL基因的表达量是未加入BMP4的2倍,生殖分化后期相关基因VASA表达略有上升,TEKT1的表达无明显变化;诱导分化实验尚未形成单倍体的精子.结论 BPM4因子可促进人隐睾特异性诱导多能性干细胞在体外分化形成原始生殖细胞,为将来继续诱导形成单倍体精子打下了重要的基础,为隐睾的防治提供借鉴.

应用温度敏感型培养皿获得尿道下裂患儿尿源性细胞膜片的研究

目的探讨通过Nunc Upcell温度敏感型培养皿获得尿道下裂患儿尿源性细胞膜片的可行性。方法排尿时，对尿道下裂患儿尿源性细胞进行收集和原代培养，传代后计数细胞并绘制生长曲线，观察细胞形态学特征，RT-PCR、细胞免疫荧光染色鉴定尿源性细胞特异mRNA及蛋白表达情况；将尿道下裂患儿尿源性细胞转移入Thermo公司的Nunc Upcell中，根据温度的变化获得该细胞的细胞膜片。结果镜下观察和生长曲线图显示：尿道下裂患儿来源的尿源性细胞具有与正常人的尿源性细胞类似的体外增殖能力，培养至第十代生长仍很旺盛，可以达到10^9个细胞，能够满足组织工程所需要的细胞数量；2组细胞具有类似的群体倍增时间；RT-PCR和细胞免疫荧光染色显示这2组尿源性细胞均表达尿道上皮细胞和平滑肌细胞表面标志物；利用NuncUpcell温度敏感型培养皿可以转移得到完整的细胞膜片，且转移后的细胞仍保持旺盛的增殖能力。结论尿道下裂患儿来源的尿源性细胞可在体外大量增殖，可作为一种新型的种子细胞用于泌尿系统组织工程；结合使用新型的NuncUpcell温度敏感型细胞培养皿，可获得尿道下裂患儿尿源性来源细胞的细胞膜片，为将来进行尿道缺损修复的动物及临床试验奠定了良好基础。

尿源性干细胞多向诱导分化及诱导后平滑肌复层细胞膜片的构建

目的 通过对尿道下裂患儿尿源性干细胞进行多向诱导分化，探讨其诱导分化潜能；利用诱导后的平滑肌样细胞进行复层细胞膜片构建，评价其在无外源性支架情况下获得自体组织工程补片的可行性。方法 程序性添加细胞因子将尿源性干细胞向平滑肌细胞、内皮细胞和神经细胞方向诱导分化，通过实时定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光染色鉴定其诱导效率。诱导后的平滑肌样细胞转移入温度敏感型培养皿（NuncUpcell）中，降低温度获得单层细胞膜片，将单层细胞膜片多次叠加，获得复层平滑肌细胞膜片。结果 ①实验中采集到的尿源性干细胞均表达不同程度的Oct4、Sox2、Nanog等胚胎干细胞特异性标志物，且随诱导时间延长，其表达逐渐减低。②在不同方向的诱导过程中，平滑肌、内皮细胞特异性均逐渐增强。平滑肌细胞特异性标志物α-SMA和Desmin的阳性率在诱导前分别为9.350 0%和16.736 7%，在诱导后分别为91.543 3%和89.093 3%，前后比较，差异均有统计学意义（P〈0.0001）。内皮细胞特异性标志物CD31和vWF的阳性率在诱导前分别为2.613 3%和29.396 7%，在诱导后分别为66.860 0%和74.780 0%，前后比较，差异均有统计学意义（P〈0.0001及P＝0.0001）。神经特异性标志物Nestin的阳性率在诱导前、后分别为49.856 7%和90.990 0%，前后比较，差异有统计学意义（P＝0.000 4）。但神经细胞方向诱导形态变化不明显，未形成神经祖细胞标志性＂花环样＂结构。③诱导后的平滑肌样细胞结合温度敏感型培养皿可获得复层平滑肌细胞膜片。结论 尿源性干细胞向平滑肌和内皮细胞方向诱导效果较好，而神经细胞方向诱导效果欠佳；结合温度敏感型培养皿可获得诱导后平滑肌复层细胞膜片，为泌尿系统组织工程修复提供了新的思路。

含氢培养基调节巨噬细胞RAW264.7极化的机制研究

目的观察含氢培养基对巨噬细胞RAW264.7极化的影响,并初步探讨巨噬细胞的功能。方法分别采用常规培养和含氢培养基培养巨噬细胞RAw264.7(M0),予以脂多糖(lipopolysac-charide,LPs)20ng/mL和干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)50ng/mL诱导M1型极化,白细胞介素4(interleukin,IL-4)20ng/mL诱导M2型极化,采用相差显微镜观察细胞形态学变化,CCK-8法检测细胞活力,实时荧光定量PCR(quantitative real-time,qPCR)检测相关炎症基因表达情况,流式细胞仪检测M1型巨噬细胞膜蛋白CD16/32和M2型巨噬细胞膜蛋白CD206比例变化,westem blot检测核转录因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)表达变化,划痕实验检测细胞迁移能力。结果巨噬细胞予以LPS和IFN-γ诱导后显示M1型极化,表现为轴突细而长;予以IL-4诱导后显示M2型极化,表现为轴突短而小。炎症因子(iNOS、TNF-α、和IL-1β)在M1型巨噬细胞中以及IL-10和YM-1在M2型巨噬细胞中表达显著增加(P<0.05)。氢气对RAw264.7的活力无显著影响。含氢培养基可降低M1型巨噬细胞促炎症因子表达和膜蛋白CD16/32表达下降,核转录因子NF-κB(P65)入核减少,并降低M1型巨噬细胞的迁移能力。但对M2型巨噬细胞的极化及功能无显著影响(P>0.05)。结论含氢培养基减少M1型巨噬细胞炎症因子表达和膜蛋白CD16/32比例,并降低M1型巨噬细胞迁移能力,可能与核转录因子NF-κB(P65)入核减少有关。

多能干细胞向雄性生殖细胞定向分化的研究进展

生殖健康是生命科学领域关注的核心之一,各种原因所致男性不育亟待解决,然而由于伦理限制等原因,缺少合适的具有人类遗传背景的研究模型开展研究。胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)均属于多能干细胞,具有多向分化潜能。一方面,可利用ESCs/iPSCs向生殖细胞分化的模型研究人类生殖细胞的发育规律,另一方面,在此基础上,可建立带有人类疾病遗传背景的iPSCs模型,体外诱导其向雄性生殖细胞分化,利用该模型研究男性不育的发病机制。由于精子在体内的形成遵循一定规律,体外环境中不同发育阶段的生殖细胞在不同诱导因子作用下才可稳定地往下一阶段定向分化,因此,诱导ESCs/iPSCs向雄性生殖细胞方向分化时,诱导因子的种类和加入时间的选择应根据生殖细胞的体内发育特征而定,并且在诱导的不同阶段循序加入,以此模拟精子在体内的形成过程,进而更好地研究男性不育的发病机制。本文将对多能干细胞向雄性生殖细胞定向分化的常用诱导因子及存在问题和展望进行综述,为相关研究的开展提供借鉴。

人胚胎干细胞饲养层培养体系的研究进展

人胚胎干细胞（hES细胞）来源于着床前人囊胚内细胞团（ICM），由于具有体外无限增殖和分化成3个胚层来源的各种细胞的潜能，使其成为当今生命科学的研究热点。建立一个理想的hES细胞培养体系是利用它的前提。目前，最常用的hES细胞的体外培养方式是将其培养在饲养层细胞上。迄今为止，已经有多种细胞用于hES细胞的体外培养。饲养层的存在不仅为hES细胞的生长繁殖提供了一个稳定的外环境，同时也维持了hES细胞无限增殖与分化的特性；然而衰老的、不合适的饲养层会对hES细胞产生负面影响。对不同来源的饲养层细胞作一综述，比较不同种类的饲养层细胞的优缺点，旨在为将来的研究提供借鉴。