霉菌实时荧光核酸恒温扩增检测技术研究

以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC(16404)DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT),并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性。结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L^-1及探针浓度为10μmol·L^-1时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-7.061x+59.567,R^2=0.961 1),该方法的灵敏度为10^3个·mL^-1孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100%,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒方法验证比对研究

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing,SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测食源性致病菌如志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM、阪崎肠杆菌的一致性。方法以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差异检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性:志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157∶H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157∶H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确度高的优点,无一例漏检。

食源性霉菌和酵母菌检测技术进展

真菌广泛存在于空气、水、各种动植物体和有机体中,在生长过程中产生容易引起人和动物生理变化和病理变化的次级代谢产物,导致人类和动物的急性或慢性中毒。因此,快速准确地检测食品中污染真菌已成为保障食品安全和预防疾病的重要环节。污染食品的真菌主要是霉菌和酵母菌,对其检测方法有多种,但不同检测方法各有其优势和不足以及不同的应用范围,就近年来食源性霉菌和酵母菌检验方法作一简要概述。

猪瘟病毒实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立与评价

为了建立猪瘟病毒(CSFV)实时荧光核酸恒温扩增检测方法,采用特异性磁珠RNA捕获探针从组织、血液、排泄物和培养物等样本中提取病毒核酸,进行实时荧光恒温扩增检测,与传统的实时荧光检测技术相比,本试验建立的猪瘟病毒SAT检测方法操作简便,耗时短,整个扩增过程在42℃恒温下完成,没有频繁的升降温过程,缩短了检测时间,50 min内可完成检测。该方法特异性强,对多种相关猪病病毒进行检测无交叉反应。该方法灵敏度高,与实时荧光PCR相比均可达到100个拷贝数。该方法适用于猪瘟病毒的快速检测和监测。