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建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统
被引量:
1
1
作者
潘欣
曾思良
+6 位作者
宋维
余秀珍
张俊
张鸿声
方伟
陈敏
廖万清
《生物技术通讯》
CAS
2014年第2期151-157,共7页
目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特...
目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特异性重组慢病毒或非组织特异性重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染靶细胞,用六氧苄基鸟嘌呤/卡莫司汀联合筛选以富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;用六亚甲基二乙酰胺诱导富集的阳性细胞向红细胞分化,流式细胞术检测红色单体荧光蛋白报告基因的表达,荧光显微术观察基因表达产物在细胞中的定位,免疫印迹分析L-ASNase的表达水平,评估在红细胞分化过程中组织特异性重组慢病毒的表达优势。结果:经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的重组慢病毒载体结构正确;免疫荧光结果显示在非组织特异性慢病毒感染的HeLa细胞中,L-ASNase主要表达在细胞质,单体红色荧光蛋白主要表达在细胞核内,提示2A序列通过自裂解使同一读框中的2个基因获得了表达;用50μmol/L六氧苄基鸟嘌呤-50μmol/L卡莫司汀联合筛选,可有效富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;经六亚甲基二乙酰胺诱导,第7 d的MEL细胞中表达的重组L-ASNase浓度达0.3 U/mg总蛋白。结论:红细胞特异性慢病毒载体可以在小鼠红白血病细胞向红细胞分化过程中使携带基因的表达逐步增高,优于非组织特异性慢病毒载体。本研究为基因修饰造血干细胞、并通过体外细胞分化的方法大量产生携带L-ASNase的红细胞治疗恶性血液病奠定了临床前的实验基础。
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关键词
慢病毒载体
左旋天门冬酰胺酶
红细胞特异性
基因调控
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职称材料
结核分枝杆菌Rv0733-6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定
2
作者
潘欣
蔡家麟
+8 位作者
王颖
陈建霞
曾思良
方伟
陈敏
廖万清
余秀珍
张俊
宋维
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2013年第5期18-24,共7页
单域重链抗体是目前中和胞内病原体抗原的重要分子之一,研究以结核分枝杆菌Rv0733-6His融合抗原为靶标,对羊驼非免疫单域重链抗体库进行了3轮淘洗,通过ELISA和测序方法,从1 024个克隆中筛选出10个独立单域重链抗体序列,继而用原核表达...
单域重链抗体是目前中和胞内病原体抗原的重要分子之一,研究以结核分枝杆菌Rv0733-6His融合抗原为靶标,对羊驼非免疫单域重链抗体库进行了3轮淘洗,通过ELISA和测序方法,从1 024个克隆中筛选出10个独立单域重链抗体序列,继而用原核表达并鉴定了1株Rv0733-VHH-Fc-6His抗体。免疫印迹和免疫荧光结果均显示Rv0733-VHH-Fc-6His抗体可以特异性地结合Rv0733抗原。提示Rv0733-VHH抗体可能具备结合胞内菌相关抗原的潜力。
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关键词
结核分枝杆菌
表达纯化
单域重链抗体
噬菌体抗体库
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职称材料
题名
建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统
被引量:
1
1
作者
潘欣
曾思良
宋维
余秀珍
张俊
张鸿声
方伟
陈敏
廖万清
机构
上海俊维寓医馆
上海
市中原中学
同济大学
第二军
医
大学
出处
《生物技术通讯》
CAS
2014年第2期151-157,共7页
基金
国家重点基础研究发展计划(2013CB531601)
国家自然科学基金(30972633)
文摘
目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特异性重组慢病毒或非组织特异性重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染靶细胞,用六氧苄基鸟嘌呤/卡莫司汀联合筛选以富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;用六亚甲基二乙酰胺诱导富集的阳性细胞向红细胞分化,流式细胞术检测红色单体荧光蛋白报告基因的表达,荧光显微术观察基因表达产物在细胞中的定位,免疫印迹分析L-ASNase的表达水平,评估在红细胞分化过程中组织特异性重组慢病毒的表达优势。结果:经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的重组慢病毒载体结构正确;免疫荧光结果显示在非组织特异性慢病毒感染的HeLa细胞中,L-ASNase主要表达在细胞质,单体红色荧光蛋白主要表达在细胞核内,提示2A序列通过自裂解使同一读框中的2个基因获得了表达;用50μmol/L六氧苄基鸟嘌呤-50μmol/L卡莫司汀联合筛选,可有效富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;经六亚甲基二乙酰胺诱导,第7 d的MEL细胞中表达的重组L-ASNase浓度达0.3 U/mg总蛋白。结论:红细胞特异性慢病毒载体可以在小鼠红白血病细胞向红细胞分化过程中使携带基因的表达逐步增高,优于非组织特异性慢病毒载体。本研究为基因修饰造血干细胞、并通过体外细胞分化的方法大量产生携带L-ASNase的红细胞治疗恶性血液病奠定了临床前的实验基础。
关键词
慢病毒载体
左旋天门冬酰胺酶
红细胞特异性
基因调控
Keywords
lentiviral vector
L-asparaginase
erythroid-specific
transcriptional regulation
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
Q25 [生物学—细胞生物学]
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职称材料
题名
结核分枝杆菌Rv0733-6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定
2
作者
潘欣
蔡家麟
王颖
陈建霞
曾思良
方伟
陈敏
廖万清
余秀珍
张俊
宋维
机构
上海俊维寓医馆
第二军
医
大学
上海
交通大学基础
医
学院
上海
市肺科
医
院
出处
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2013年第5期18-24,共7页
基金
国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(2013CB531601)
国家自然科学基金(30972633)
文摘
单域重链抗体是目前中和胞内病原体抗原的重要分子之一,研究以结核分枝杆菌Rv0733-6His融合抗原为靶标,对羊驼非免疫单域重链抗体库进行了3轮淘洗,通过ELISA和测序方法,从1 024个克隆中筛选出10个独立单域重链抗体序列,继而用原核表达并鉴定了1株Rv0733-VHH-Fc-6His抗体。免疫印迹和免疫荧光结果均显示Rv0733-VHH-Fc-6His抗体可以特异性地结合Rv0733抗原。提示Rv0733-VHH抗体可能具备结合胞内菌相关抗原的潜力。
关键词
结核分枝杆菌
表达纯化
单域重链抗体
噬菌体抗体库
Keywords
Mycobacterium tuberculosis
expression purification
single domain of heavy-chain antibody
phage display antibody library
分类号
R378.911 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统
潘欣
曾思良
宋维
余秀珍
张俊
张鸿声
方伟
陈敏
廖万清
《生物技术通讯》
CAS
2014
1
下载PDF
职称材料
2
结核分枝杆菌Rv0733-6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定
潘欣
蔡家麟
王颖
陈建霞
曾思良
方伟
陈敏
廖万清
余秀珍
张俊
宋维
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2013
0
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职称材料
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