转基因克隆技术与猪的遗传育种

动物克隆技术的研究现状及其发展趋势１、克隆动物研究背景“克隆”在生物学上有多个概念，但其基本含义系指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，克隆出的细胞或个体具有完全相同的遗传性状，常称“无性繁殖系”（细胞系）。因...

上海某猪场发现基因3型和基因4型戊型肝炎病毒共存

在对猪戊型肝炎流行病调查过程中,通过Nested RT-PCR方法,扩增基因组ORF2的150 bp目的片段,测序并进行分析。结果表明:某猪场同时存在3型和4型HEV,这是我国首次在同一个猪场发现不同基因型HEV共同感染的报道。对基因3型HEV在该猪场流行趋势进行跟踪调查,基因3型阳性率最高达20%,最低4%,平均11.5%;基因4型最高阳性率30%,最低20%,平均23.5%。此研究结果提示基因3型HEV在该猪场与基因4型相比在竞争感染中不占主导优势。

毛喉素对猪卵母细胞降脂及冷冻保护效果研究

猪卵母细胞脂质含量高被认为是其冷冻效率低下的重要因素之一。本文通过在猪卵母细胞体外成熟过程中添加化学降脂剂毛喉素(forskolin),检测冷冻前后成熟卵母细胞的脂滴含量、脂滴超微结构、线粒体膜电位、活性氧水平、早期凋亡指标、冻后存活率及发育潜能变化等,研究其对猪卵母细胞降脂和冷冻保护的效果。结果显示,成熟过程中毛喉素处理可部分提高卵母细胞成熟率,但差异不显著(P>0.05)。尼罗红荧光染色显示,毛喉素处理后卵母细胞内脂滴数量及面积在冷冻前后均极显著低于未处理组(P<0.01);超微结构观察发现,经毛喉素处理的卵母细胞中非均质脂滴数量与均质脂滴数量的比例扩大,且比均质脂滴面积更大;冷冻后,卵母细胞中以非均质脂滴为主,脂滴变小变少,分布不均匀,毛喉素处理后非均质与均质间的脂滴数量比例进一步增加。毛喉素处理极显著上调冻后卵母细胞线粒体膜电位(1.04 vs. 0.51,P<0.01),减轻氧化应激,降低早期凋亡率(68.30%vs. 86.03%,P<0.01),从而有效提高了冷冻后卵母细胞的存活率(71.17%vs. 51.47%,P<0.01)和孤雌激活卵裂率(16.63%vs. 8.23%,P<0.05)。本研究表明,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加毛喉素可有效降低细胞内脂质含量,并通过降低氧化损伤和改善线粒体功能,达到提高冻后存活率和发育能力的目的。

中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展

2010—2011年中国境内的猪流行性腹泻(PED)大流行给养猪业造成重大经济损失。因疫苗免疫无法控制疫病流行,因此学者普遍认为猪流行性腹泻病毒(PEDV)出现了新的变种。论文综合分析了这个时期国内学者PEDV分子流行病学的研究结果,又对国内新近分离的PEDV的11个毒株的全基因序列进行遗传进化分析,进一步确定了国内暴发流行的PEDV毒株已远离中国86年分离的毒株和欧洲毒株CV777,成为了一个新的基因型。毒株基因变异应该是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。进一步分析发现分离毒株的全长基因序列和棘突蛋白(S)基因序列长度有差异,其他基因长度保守性强。S基因的变异率高于其他基因,特别是短期内基因突变主要发生于S基因。综合分析认为国内变异毒株虽与韩国毒株遗传关系较近,但从境内毒株衍生和进化而来的可能性更大。因2006年已经观察到PEDV的免疫失效和PED流行,2010—2011年PED集中暴发可能是病原长期突变和适应性积累的结果,提示今后应充分发挥全国动物疫病预警网络的作用,加强毒株进化检测和疫病预警,优化疫病的防控手段,降低疫病发生频次和规模,减小疫病发生损失。

细胞松弛素B改善冷冻引起的猪卵母细胞皮质颗粒迁移障碍

旨在揭示冷冻后的猪GV期卵母细胞体外成熟过程中细胞骨架与皮质颗粒迁移之间的相互关系和影响。所采集猪卵巢样品来自上海市嘉定区五丰上食屠宰场的健康经产母猪,每次采样选用体重70~90 kg、生产性能良好的浦东白母猪300头左右采取卵巢样品,采集卵巢数量120~150枚·次^(-1),挑选胞质分布均匀且紧密的GV期卵母细胞按试验要求随机分为3组,每组设3个重复,每组至少30枚细胞,利用细胞骨架稳定剂细胞松弛素B (cytochalasin B,CB)冻前处理猪GV期卵母细胞,冷冻解冻后经体外成熟培养,检测卵母细胞存活率、各时间点微丝与皮质颗粒荧光共定位情况、卵丘扩散程度、第一极体排出率、谷胱甘肽(glutathione, GSH)水平和发育能力等指标。结果显示,冷冻前用CB处理可有效提高GV期卵母细胞解冻后存活率(44.11%vs. 27.91%,P<0.01)。在新鲜卵母细胞成熟过程中,可观察到皮质颗粒与微丝存在共迁移。冷冻会引起皮质颗粒-微丝迁移异常,而冷冻前CB的添加会缓解冷冻引起的迁移障碍,表现为CB处理组的微丝与皮质颗粒均成功迁移至质膜的比例更高,迁移均匀分布于质膜效果更好。冷冻卵母细胞体外成熟后,CB预处理的第一极体排出率((26.79±2.37)%vs.(8.13±0.30)%,P<0.01)、GSH水平(23.12±2.65 vs. 7.27±0.79,P<0.01)和孤雌激活后的卵裂率((20.91±2.84)%vs.(5.64±0.37)%,P<0.01)与囊胚率((5.00±0.03)%vs.(0.41±0.01)%,P<0.05)均有显著提高。本研究表明,微丝细胞骨架对卵母细胞体外成熟过程中胞内皮质颗粒由内部向质膜迁移有一定的调节作用,且两者存在一定共定位关系,通过冻前添加CB孵育可有效影响细胞微丝骨架与皮质颗粒的迁移程度,减轻了冷冻引起的细胞骨架异常分布,缓解了由冷冻引起的皮质颗粒-微丝迁移障碍,进而提升细胞抗冻能力,表现为促进胞质成熟的同时,提高了冷冻卵母细胞存活率、核成熟率与胚胎体外发育潜能。

基因工程牛生长激素高密度发酵表达的研究

通过对重组牛生长激素基因工程大肠杆菌摇瓶和5、30 L发酵罐发酵表达的研究,建立了基因工程牛生长激素的高密度发酵表达工艺,菌体密度最高可达到OD550=120,rbIL-2的表达量占菌体总蛋白的20%以上。

LT粘膜佐剂对鸡新城疫疫苗的免疫增强作用研究

研究大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白(heat-labile enterotoxin,LTRG)对鸡新城疫(Newcastle disease virus,NDV)疫苗经不同途径接种效果的影响。以NDV LaSota株作为共免疫原,与LTRG重组蛋白经滴鼻、口服及肌肉注射三种途径接种雏鸡,通过血清IgG抗体、HI抗体及粘膜分泌型IgA抗体水平变化,评价不同途径接种LTRG对NDV疫苗的免疫效果的影响。结果显示:①三种途径接种,LTRG均能显著增强NDV疫苗的免疫抗体水平,免疫雏鸡血清抗体和粘膜抗体水平均高于NDV疫苗单独免疫组;②LTRG对NDV疫苗免疫增强作用,以滴鼻接种最显著:二、三免后LTRG+NDV滴鼻组与NDV组血清IgG、粘膜IgA差异均显著(P<0.01、P<0.05);LTRG+NDV口服与NDV组血清IgG差异不显著(P>0.05)、粘膜IgA差异极显著(P<0.01);LTRG+NDV肌注与NDV组IgG差异不显著(P>0.05)、粘膜IgA差异显著(P<0.05);③三种免疫途径比较:血清IgG抗体水平差异均不明显(P>0.05);滴鼻、口服免疫可诱导雏鸡产生较高的粘膜IgA抗体、血清HI抗体。由此可见:LTRG粘膜佐剂对NDV疫苗免疫增强作用,以粘膜(滴鼻、口服)途径接种效果最为显著,能诱导高水平的粘膜IgA抗体及血清抗体。

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素(labile enterotoxin,LT)作为粘膜佐剂,配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响,在前期已经构建的LTR72/G192基础上,选择2、4μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量,及降低新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗,进行雏鸡免疫试验,免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结,检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明:IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24h即升高,48 h达最高值;添加2、4μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高,其中含4μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义(P<0.01);IL-6、IFN-γ转录水平有所增强,但各组间差异不具有显著统计学意义(P>0.05),72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降,与NDV疫苗接种组相近。由此可见,LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答,有利于对感染病毒的清除。

干扰素诱导蛋白IFIT研究进展

干扰素诱导蛋白(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats, IFITs)是机体先天免疫系统中,当病原体、肿瘤细胞等微生物刺激相关受体,促使机体免疫细胞诱导表达干扰素后,产生的干扰素刺激因子之一,起抑制病毒复制增殖、抵抗病毒感染的作用。1 IFIT的产生机体的先天免疫,主要包括机体产生的干扰素触发和干扰素的抗病毒效应,建立极其有效的抗病毒状态.

家畜精子耐冻性机制研究进展

精子耐冻性的个体间差异性在不同家畜均普遍存在,制约着家畜精液冷冻保存技术的进一步发展。本文系统综述了近年来家畜精子耐冻性机制研究进展,以期为揭示家畜精子耐冻性机制提供参考。

多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。

体细胞克隆技术及其存在的问题

阐述了体细胞克隆技术在生命科学和畜牧业中应用的重大价值,该技术是当今生物技术中最重要的研究领域之一,但还存在着一些问题;详细分析、讨论了目前克隆技术存在的问题。

国内外小型猪实验动物化研究

生命科学研究和生物医药产业的迅猛发展对实验动物,尤其是动物模型提出了越来越高的要求。猪在心血管系统、消化系统、皮肤结构、骨骼发育和营养代谢等方面与人极其相似,因此一直是医学研究的重要动物模型,更是人类异种器官、组织、细胞移植的首选供体。详细介绍了国内外小型猪实验动物化研究进展。

猪胚胎的OPS玻璃化冷冻

以广西巴马小型猪为供体，采用超数排卵技术，采集5～6日龄具有完整透明带的胚胎（囊胚／桑葚胚），采用二步法OPS（Open pulled straw）玻璃化冷冻技术进行保存，即胚胎首先在冷冻液1（TCM199＋20％FBS＋10％EG＋10％DMSO）中平衡3min，然后立即转入冷冻液2（TCM199＋20％FBS＋20％EG＋20％DMSO＋0．4mol／LSUC）中并在1min内装管（每管含2～6枚胚胎），直接投入液氮保存；3个月后解冻移植给8头受体母猪（每头移入25～26枚胚胎），其中1头怀孕产仔（8头活仔），获得猪胚胎超低温（-196C）冷冻后代。

口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较

以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。

动物胚胎生物技术发展概况

本文概述了近30年来胚胎生物技术包括体外受精与显微受精、孤雌生殖、胚胎分割与嵌合、配 子与胚胎的冷冻保存、胚胎干细胞、转基因、克隆动物技术的发展及在实验动物上的应用前景。

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗。体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38ku,主要以包涵体形式存在。重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应。ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体。利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础。

表达FMDV 3AB抗原生产菌株稳定性试验

重组表达菌株的稳定性是决定试剂盒抗原生产的关键因素,对本室构建的重组菌株rNS- 3ABplysS携带质粒和表达蛋白的稳定性进行了研究,在含Amp的斜面连续传1～10代时,分别作了检测连续传代质粒、携带质粒DNA、抗原蛋白表达的稳定性试验。发现各菌株携带质粒稳定性较好,酶切及电泳图谱未有明显改变,且外源目标蛋白可稳定表达,可作为理想菌株。

原花青素对湖羊冻精抗氧化能力的影响

在湖羊冻精基础稀释液中分别添加原花青素(PC),使其最终质量浓度为0μg/mL(CK)、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL,经冷冻解冻后对精子质量进行检测,探讨原花青素对湖羊精液冷冻效果的影响。结果表明:当PC的质量浓度为10μg/mL时,解冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达58.91%、56.03%、50.03%、53.42%和50.19%,其中活力和质膜完整性显著高于对照组;SOD值和GSH-PX值分别为212.60U/mL和125.04UL,均显著高于对照组;ROS和MDA值分别为363.05U/mL和7.02nmolL,显著低于对照组;NO和NOS值分别为8.22μmol/L和35.90μmol/L,其中NOS值显著低于对照组。当PC的质量浓度提高至40μg/mL时,精子解冻后质量显著下降,表现为促氧化损伤。在湖羊精液冷冻中,添加10μg/mL的PC可降低精子氧化损伤,提高冻精品质,当PC质量浓度提高至40μg/mL时,对精子具有毒副作用。