鸭乙型肝炎病毒PreS蛋白片段在大肠杆菌中的高效表达及初步应用

将编码鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）前表面抗原（ＰｒｅＳ）第９至１６３位（１５５个）氨基酸序列的４６５ｂｐＤＮＡ片段，克隆入ＰＬ启动子控制下并含有修饰型ｃＩｔｓ８５７基因的表达载体中。利用载体的起始密码子和创建的终止密码子（ＴＡＧ）构建含部分ＤＨＢＶＰｒｅＳ基因的表达质粒。在大肠杆菌ＡＲ６８ｐＲＫ２４８中，本质粒经温敏诱导，表达产物为１７．５ｋＤａ，约占细菌总蛋白的５％。用Ｗｅｓｔｅｍｂｏｌｔ分析，本表达产物可与特异性ＤＨＢＶＰｒｅＳ／Ｓ抗体反应。以表达产物组建固相基质抗体抗原复合物，可部份逆转对ＤＨＢＶ的免疫耐受状态。

乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２）及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统，供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞，并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液，用ＥＬＩＳＡ法测定ＳＥＡＰ活性及ＨＢｓＡｇ。结果在三种细胞中ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ均可表达，以７２小时表达的酶活性测定最为适宜；而ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ表达仅处于低水平。以ＳＥＡＰ表达量作为内参对ＨＢｓＡｇ的表达量进行比较，发现Ｓ基因１２９Ｌ变异体表达ＨＢｓＡｇ量显著高于野毒株。结论ＳＥＡＰ作为内参具有快速简便，不需同位素及特殊仪器的优点，有较高的实用价值。

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

目的 对比研究在体外细胞培养系统中乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 在肝、肾细胞中的复制与表达。方法 用克隆 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ（ｐ１７７ 、ｐ３ ．８ Ⅱ、ｐ Ｃ Ｍ Ｖ３ ．９） 分别转染 Ｈｅｐ Ｇ２ 与２９３ 细胞系；ｐ１７７ 与ｐ３ ．８ Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液，用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法检测 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 与 Ｈ Ｂｅ Ａｇ ；提取转染细胞的 Ｄ Ｎ Ａ 与 Ｒ Ｎ Ａ，进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 与 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交检测细胞内 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 与 Ｈ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ。结果 转染 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞， Ｈ Ｂｓ Ａｇ 与 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 均有高水平表达； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 与 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交显示特异的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 与 Ｈ Ｂ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 杂交信号。而转染２９３ 细胞后， Ｈ Ｂｓ Ａｇ 与 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 仅出现很低水平表达； Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交除ｐ Ｃ Ｍ Ｖ３ ．９ 转染细胞出现明显的 Ｈ Ｂ Ｖ 特异杂交信号外，其他为阴性或微弱阳性。转染原代人胚肾细胞均无 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 与 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 表达。结论 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 在肝细胞中可以复制与表达，在肾细胞中仅有低水平的病毒抗原表达而无复制，只?

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达与DNA免疫研究

目的研究我国发现的乙肝病毒Ｓ基因突变株（１２９Ｌｅｕ和１４５Ａｒｇ）表达ＨＢｓＡｇ及ＤＮＡ免疫的特性。方法用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的２株变异Ｓ基因（其中“ａ”决定簇突变，分别为ｎｔ５４０Ａ→Ｔ，ａａ１２９Ｇｌｎ→Ｌｅｕ和ｎｔ５８７Ｇ→Ａ，ａａ１４５Ｇｌｙ→Ａｒｇ）片段，置换已知核苷酸序列并可表达及复制的ＨＢＶ１．２个拷贝全基因野毒株重组质粒ｐ３．８Ⅱ的Ｓ基因。将重组质粒转染ＨｅｐＧ２细胞，用Ａｂｂｏｔ试剂和２４种单抗检测转染细胞培养上清中ＨＢｓＡｇ的结合力。用重组质粒ＤＮＡ肌肉免疫小鼠。结果１２９Ｌｅｕ变异株转染细胞上清对ＨＢｓＡｇ酶联免疫反应检测的吸光度（Ａ）值高于ｐ３．８Ⅱ野毒株，而１４５Ａｒｇ变异株的Ａ值低于ｐ３．８Ⅱ；用２４种单抗测定的总趋势为１２９Ｌｅｕ表达的ＨＢｓＡｇ的Ｓ／Ｃ值高于ｐ３．８Ⅱ，而１４５Ａｒｇ的结果则低于ｐ３．８Ⅱ。三者表达的ＨＢｅＡｇ水平相似。用ＤＮＡ免疫经１２９Ｌｅｕ诱生的抗－ＨＢｓ水平低于野毒株ｐ３．８Ⅱ，但略高于１４５Ａｒｇ。结论１２９Ｌｅｕ变异株表达的ＨＢｓＡｇ与ＨＢｓ多抗及单抗的结合力较野毒株明显增高，但１２９Ｌｅｕ变异株ＤＮＡ免疫诱生的抗－ＨＢｓ水平却低于?

反义寡脱氧核苷酸在鸭体内抑制鸭乙型肝炎病毒复制与表达的研究

目的研究反义核酸的抗病毒作用。方法设计合成了针对鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）前Ｓ（ＰｒｅＳ）基因区第９５１９６８位核苷酸的硫代反义寡脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ），以２０μｇ／ｇ体重／日剂量对３只腹腔感染ＤＨＢＶ５２毒株后，血清ＤＨＢｓＡｇ及ＤＨＢＶＤＮＡ阳性鸭连续静脉注射１０天，同时以等体积生理盐水注射另３只感染鸭作为对照。结果对照鸭注射生理盐水后，血清ＤＨＢｓＡｇ及ＤＨＢＶＤＮＡ阳性未见明显改变，肝组织ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交在３０与２３ｋｂ左右杂交信号明显。注射ＡＳＯＤＮ鸭在１０天后，２／３鸭血清ＤＨＢｓＡｇ及ＤＨＢＶＤＮＡ量显著降低，３／３鸭肝组织中３０ｋｂ左右的杂交信号显著减弱，２３ｋｂ左右未见杂交信号。结论说明该段ＡＳＯＤＮ在鸭体内能部分抑制ＤＨＢＶ的复制与抗原表达。

外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒前S/S基因变异的研究

目的研究外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）包膜抗原基因变异的意义。方法收集１９例慢性乙肝患者的ＰＢＭＣ和配对血清，用ＰＣＲ扩增ＰＢＭＣ及血清中ＨＢＶ包膜基因片段（Ｓ，ｐｒｅＳ１，ｐｒｅＳ２），并对其中各５例ＰＢＭＣ及配对血清中的ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２基因片段，分别进行核苷酸序列分析。结果Ｓ、ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２片段在血清和ＰＢＭＣ中的检出率，分别为１００％、９４７％、１００％和０、２６３％、２６３％。与ＨＢＶＡＤＲ序列比较，１０份标本ＨＢＶＤＮＡ核苷酸序列分析，发现２份ｐｒｅＳ１和３份ｐｒｅＳ２的核苷酸序列，没有发生改变；８份ｐｒｅＳ１和７份ｐｒｅＳ２的核苷酸序列，均发生了一个至多个位点的点突变。结论ＰＢＭＣ中存在的包膜基因不完整，因而不会形成完整的ＨＢＶ病毒颗粒，故不支持ＨＢＶ可潜伏于ＰＢＭＣ并发展成为体内ＨＢＶ再感染的来源。ｐｒｅＳ１点突变编码的氨基酸位点，集中在ａａ２１～４７区域，可能会影响ＨＢＶ的吸附和穿入，及组织亲嗜性的改变。ＨＢＶ亚基因片段在ＰＢＭＣ中，是否会影响细胞的功能，有待进一步研究。