DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD34^+细胞后耐药特征的研究

目的 增强脐血 CD34+造血细胞对化疗药物的耐药表型 ,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性 ,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法 应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤 - DNA-甲基转移酶 (O6 - methylguanine- DNA-methyltransferase,MGMT) c DNA;利用基因重组技术 ,将其克隆于 p GEM- T质粒载体并构建了逆转录病毒载体 G1Na- MGMT;应用脂质体 L ipofect AMINE基因转移法将后者导入 GP+ E86和 PA317病毒包装细胞 ,以卡氮芥 1,3- Bis(2 - Chloroethyl) - 1- Nitrosourea(BCNU)加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血 CD34+ 细胞。应用 PCR,Southern Blot,RT- PCR,Northern blot,Western Blot及 MTT法检测 MGMT基因在脐血 CD34+ 细胞中的转移和表达。结果 酶切鉴定及 DNA测序证实了 MGMT c DNA克隆的正确性 ,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞 ,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达1.6× 10 6 CFU/ml,逆转录病毒载体介导的 MGMT基因在脐血造血干细胞中获得了有效转移和表达。转MGMT耐药基因脐血造血干 /祖细胞对 BCNU的抗药性较对照组提高了 4倍。结论 DNA修复蛋白MGMT基因的克隆并导入脐血造血干 /祖细胞可?