快速检测乙型肝炎病毒前核心区基因变异株方法的建立与初步应用

用聚合酶链反应（ＰＯＲ）选择性地扩增血清标本中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ区（Ｐｒｅ－Ｃ）后，以三种寡核苷酸探针Ｍ０（野毒株基因序列）、Ｍ１（ｎｔ．１８９８位点突变株基因序列）、Ｍ２（ｎｔ．１９９８位及ｎｔ．１９０１位上双点突变株基因序列）在极其严谨的条件下分别杂交，检测ＥＢＶＰｒｅ－Ｃ的最常见变异，结果本法具有根高的特异性。应用上述方法检测了３１份乙肝病人的血清标本，结果７份ＨＢｅＡｇ阳性标本中，有４份ＰＣＲ阳性，均与Ｍ０探针杂交，未出现变异；２４份抗－ＨＢｅ阳性标本中，有１０份ＰＣＲ阳性，其中８份表现为Ｍ０伴Ｍ１和（或）Ｍ２阳性，一份为野毒株，另一份与三种探针均不杂交。

重组治疗性乙型肝炎疫苗(YIC)的实验研究

研制了抗原－抗体复合物型乙肝治疗性疫苗。用小鼠实验证明这一治疗性疫苗的作用机理为：通过复合物中抗体Ｆｃ段与抗原呈递细胞表面的Ｆｃ受体结合，促进了细胞摄取抗原。复合物中的抗原经呈递后可比单纯抗原更有效地激活Ｔ细胞增殖，释放更多的γ－干扰素和白细胞介素－２，属ＴＨ１类型应答。复合物可在小鼠中诱生较单纯抗原诱生的抗－ＨＢｓ高１０倍以上。复合物还可诱生更强的细胞免疫，表现为经特异的抗原刺激后，γ－干扰素的 ｍＲＮＡ量增多。还发现复合物可在对 ＨＢｓＡｇ低应答鼠系中（Ｂ １０．Ｓ）诱生与正常应答鼠相当的抗体效价。在 ＨＢｓＡｇ阳性转基因鼠中，复合物可使部分鼠的 ＨＢｓＡｇ转为阴性，并可产生抗－ ＨＢｓ，反映这一疫苗具有疗效。为制备人用乙肝治疗性疫苗建立了用重组酵母菌表达的ＨＢｓＡｇ与人高效价抗乙肝免疫球蛋白组建治疗性疫苗的工艺，以及产品标化及效力的参比实验技术。

乙型肝炎病毒表面抗原-抗体复合物对抗原的加工递呈与诱生细胞因子的作用

乙型肝炎病毒表面抗原－抗体复合物对抗原的加工递呈与诱生细胞因子的作用周生华闻玉梅（上海医科大学卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海２０００３２）关键词抗原－抗体复合物，抗原递呈，细胞因子，乙型肝炎表面抗原前曾报道，乙型肝炎（乙肝）疫苗－人抗乙肝免疫球...

核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒S基因体外转录物的定点切割

选择鸭乙型肝炎病毒作为核酶的靶病毒，设计针对病毒前基因组Ｓ基因区第１２８８位和１４６９位“锤头状”核酶序列（ＲＺ１和ＲＺ２）。经体外转录及做核酶切割，ＲＺ１和ＲＺ２均有切割作用，以ＲＺ１作用更强。鉴于核酶在相当于鸭体温（４２℃）有切割作用，因此有可能在鸭体内研究其切割作用。

酵母双杂合系统在丙型肝炎病毒NS5A研究中的应用

酵母双杂合系统是在酵母细胞中研究蛋白－ 蛋白相互作用的新技术。应用该技术，以丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） 非结构蛋白５Ａ（ＮＳ５Ａ） 为“诱饵”，筛检了人肝癌细胞ＨｅｐＧ２ 来源的ｃＤＮＡ文库，获得了７ 个ＮＳ５Ａ 结合蛋白的基因克隆。报道了其中两个阳性克隆（ ＃ ２ 、＃ １６） 的结果，并对“人核小体组装蛋白相关蛋白”（Ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ －ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ，ｈＮＲＰ） 和“载脂蛋白Ａ－Ｉ”（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ Ｉ） 与ＮＳ５Ａ结合的生物学意义进行了讨论。

用固相抗体-抗原复合物逆转对鸭乙型肝炎病毒的免疫耐受性

目前我国有1亿乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)携带者,其中大多数系幼龄感染HBV,处于免疫耐受状态,而不能有效地产生免疫应答以清除病毒。我们用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染1日龄幼鸭,获得DHBV DNA及病毒表面抗原(DHBsAg)持续阳性的动物模型,类似HBV的免疫耐受状态。为探讨逆转免疫耐受状态的途径,本文设计了改变DHBsAg的提呈方式,用固相抗体-抗原(Solid matrix antibody-antigen,SMAA)复合物给耐受动物注射,结果部分耐受鸭DHBsAg转阴,并出现了抗-DHBs。

乙型肝炎病毒(HBV)核心基因的变异及分析

对１８份不同类型的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者血清及４份肝癌组织，用套式ＰＣＲ扩增ＰｒｅＣ／Ｃ基因，结果１５份标本（２份重症乙肝，３份慢性乙肝，８份肝癌患者血清及２份肝癌组织）可供进行核苷酸序列分析。１２份血清标本在Ｃ区均出现点突变（７－２５个核苷酸）并导致氨基酸改变（２－１２个氨基酸）。１份肝癌患者的血清及癌组织与另１份癌组织中获得的Ｃ基因克隆有２１３－３２４个核苷酸缺失。氨基酸的改变分布于３７个氨基酸，但很少见于第１３９－１８３位氨基酸。根据已知Ｃ基因编码的功能区分析，以诱生ＨＢｃＡｇ抗体的Ｂ细胞表位及ＨＢｅ１的Ｂ细胞表位相对较多见。比较不同类型ＨＢＶ感染者中ＨＢＶＣ基因变异率，未见明显差别，尚需对更多例数作研究。有４个氨基酸（第１９，６３，９３，９７位）改变在３份以上标本中重复出现。对这些密码子的核苷酸作定位点突变及抗原表达将进一步阐明其意义。

朊病毒及其相关疾病

疯牛病是一种目前在国际上受到特别关注的流行病。业已证实,该病为牛食用含有羊痒疫致病因子的脏器所致。尚未确定其病原体,推测与朊病毒有关。迄今尚无疯牛病传染至人引起克雅病的确切证据。采取适当卫生措施可预防疯牛病的发生。

病毒编码的启动子和增强子研究进展

本文介绍病毒编码的启动子和增强子的结构和功能特点。综述人类免疫缺陷病毒(HIV)、人单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和乙型肝炎病毒(HBV)启动子和增强子研究的主要进展,阐述这些启动子、增强子在病毒转录及调控中的作用及其机制和目前研究中有待解决的问题。

抗病毒特异性细胞免疫

参与抗病毒免疫的T淋巴细胞包括T_(DTH)、Th、Tc、Tγδ等亚群。病毒特异性Tc细胞有GD_4^+和CD_3^+两种表型。在病毒感染细胞,由病毒核酸指令合成的内源性病毒抗原和从细胞外吞入的外源性病毒抗原通过两种不同的途径提呈到细胞表面,以抗原表位-MHC复合物的形式为T细胞受体识别。Tc细胞在清除病毒和引起机体发病两方面的作用均已得到证实。用合成T细胞表位肽段作为抗病毒疫苗,在动物中已取得初步的保护效果。

海南省HB VPre-C区变异研究

本文应用快速检测ＨＢＶＰｒｅ－Ｃ基因突变方法对１１２例乙肝病人及无症状ＨＢＶ携带者（男６１例，女５１例）进行了研究。结果显示９３例ＨＢＶＤＮＡ阳性患者中有１３例有突变感染或与野生株合并感染（１４．０％），总的突变率偏低。突变感染率中，女性高于男性（Ｐ＜０．０５）。年龄较大者突变检出率有增高趋势。突变率与血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）水平无关。乙肝病人及ＨＢＶ携带者的突变检出率分别是１８．５％（５／２７）及１２．１％（８／６６）。

重组质粒DNA-抗原-抗体复合物诱生乙型肝炎表面抗体的研究

本文研究了含编码乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因的重组质粒DNA（pCMV－HBS）对HBsAg、抗·HBS免疫复合物（IC）诱生抗-HBs的影响。在Balb／c小鼠中，IC加PCMV－HBS（100μg）免疫组比单独使用IC或pCMV－HBsDNA组诱生的抗-HBs效价高，虽然略低于IC加氢氧化铝组，但无明显差异。在IC中加20μgpCMV-HBsDNA。经再次免疫亦可有效地诱生高效价的抗-HBs，可达PCMV－HBSAg100μg加IC免疫一次所诱生的杭体水平。然而在IC中加入1μgpCMV－HBs，即使再次免疫也不能使小鼠抗-HBS的阳转率达100％。此外在IC中加入载体质粒DNA（pCMV），亦可增强诱生抗-HBS。当DNA用量为100μg或20μg时，pCMV－HBs加入组诱生的抗-HBs效价略高于加入相同量的载体质粒DNA组。结果提示可用HBsAg-抗HBs免疫原性复合物加重组质粒DNA组建治疗性疫苗。

微生物基因组序列测定及其重大意义

微生物基因组测序不仅可使人们更好地了解病原微生物的致病机制以及它们与宿主的相互关系,促进寻找更灵敏及特异的病原微生物的诊断、分型手段,而且为临床筛选有效的药物及发展疫苗提供参考。此外,它还能提高对人类相关基因功能的认识,为探讨人类遗传性疾病机制提供参考。本文就微生物序列测定重大的理论及应用价值作一简要概述。

宫内乙型肝炎病毒感染婴儿免疫后特异性淋巴细胞增殖试验研究

为探讨乙型肝炎(简称乙肝)疫苗对宫内乙肝病毒(HBV)感染的作用机理,应用含HBV辅助性T淋巴细胞抗原表位的合成肽(前S_2 120～145)为刺激原,观察18例宫内HBV感染婴儿外周血特异性淋巴细胞增殖反应。结果表明,宫内HBV感染组刺激指数(SI)为1.5±0.4,明显低于急性HBV感染组(SI=3.7±1.4)。其中宫内HBV感染对乙肝疫苗无反应组SI为1.2±0.4,明显低于宫内感染接种疫苗有效组(SI=1.74±0.4)。结合血清抗HBs滴度,表明宫内HBV感染婴儿在T淋巴细胞水平对HBV抗原耐受,其耐受程度与抗HBs的产生和滴度有关。

乙型肝炎病毒全基因组研究的新方法

目的为从全基因水平研究乙型肝炎病毒变异与致病性的关系，建立血清标本经聚合酶链反应（ＰＣＲ）加酶切方法扩增及克隆ＨＢＶ全基因组的新方法。方法设计了含ＳｐｅⅠ，ＳａｌⅠ及ＳａｐⅠ酶切点的引物，分别扩增１．１５ｋｂ和２．０５ｋｂ的单链及双链ＤＮＡ区。经酶切及连接后获得ＨＢＶ全基因克隆。结果用新建立的方法直接从少量血清中克隆了ＨＢＶ全基因，转染ＨｅｐＧ２细胞可表达抗原并有胞内复制。

乙型肝炎疫苗免疫失败婴儿病毒表面抗原a决定簇基因变异的研究

为探讨我国婴儿乙型肝炎疫苗免疫失败与a决定簇基因变异的关系,用聚合酶链反应技术(PCR)及直接测序法对27例乙型肝炎疫苗免疫失败的婴儿血清标本HBsAg的a决定簇基因进行了研究。在第419-598位核苷酸区内,与共有序列比较,14/27(51.85%)份标本有碱基变异,其中13份标本有氨基酸改变。13份中仅1份在a决定簇的第二环,为第145位精氨酸取代甘氨酸,其余12份氨基酸改变的位点在第一环或其邻近5’端,分别为129,126,122,113及110。a决定簇基因变异与转氨酶升高间无相关性。结果说明a决定簇的变异可能与乙型肝炎疫苗免疫失败有一定关系,尚待进一步研究。

增加创新性,减少重复性,提高我国病毒性肝炎的研究水平

我国在病毒性肝炎的基础与临床研究已取得较大成绩。但从我国具有世界上最多的病毒性肝炎患者来看，我国的创新性成果却不多，被国际学术界公认或引用者更少。其原因除为发达国家学者对发展中国家成果存在偏见外，还有低水平重复性工作多，验证与跟踪国外报道的工作多等因...

在哺乳动物细胞中表达丙型肝炎病毒结构蛋白的研究

应用带有T7启动子的痘苗载体构建了含丙型肝炎病毒 (HCV)结构蛋白基因C ,E1和E2 /NS1的重组痘苗表达克隆 .在重组痘苗病毒vTT7所提供的T7RNA聚合酶存在下 ,在哺乳动物细胞中进行了暂时表达 .以HCV患者血清作Westernblot鉴定 ,分别检测到了核心蛋白C、包膜蛋白E1和E2的成熟表达 ,并且发现表达产物与不同来源的HCV患者血清及克隆本病毒患者不同时期的抗血清反应不同 .比较了C E1 E2在 6种不同的哺乳动物细胞中的表达情况 ,其中Vero和HeLa细胞对于这些蛋白的表达最为理想 .为了对表达产物开展进一步的研究 ,已成功地构建了能稳定表达C ,E1和E2的重组痘苗病毒株 .

乙型肝炎疫苗免疫失败小儿S基因变异及临床特点研究

目的与方法为了解乙型肝炎疫苗免疫失败小儿中乙型肝炎病毒(HBV)S 区基因变异及致病特点,应用核苷酸序列分析检测27例免疫失败小儿血清 HBVS 区基因序列.结果27例中14例有核苷酸改变,13例有氨基酸改变,其中12例氨基酸改变位于"a"决定簇.这12例中11例出现反复肝细胞损害,而另13例无核苷酸变异者仅6例存在肝细胞损害,二者间有显著性差异.结论乙肝病毒变异株感染更易导致肝细胞损伤.

质粒DNA促进HBsAg-抗HBs复合型疫苗诱生的免疫应答的研究

目的 研究HBsAg 抗HBs 质粒DNA复合型疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的类型。方法 分别以HBsAg、HBsAg 抗 HBs(IC)、pI/AmpHBs、IC pI/AmpHBs及IC pI/Amp免疫小鼠 ,检测抗 HBs的效价 ,分析抗 HBsIgG亚类 (ELISA) ;取免疫小鼠脾细胞 ,体外抗原刺激 ,用竞争性RT PCR方法检测IFN γ及IL 4mRNA转录水平。结果 IC pI/AmpHBs诱生的抗 HBs效价明显高于IC或pI/AmpHBs单独免疫组 ,其IgG2a/IgG1比值高于IC免疫组 ,而低于pI/AmpHBs免疫组。IC pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞在HBsAg刺激下 ,IFN γmRNA转录水平明显高于其他免疫组 ,其IFN γmRNA的T/C(目的片段Target/竞争片段Competitor)比值为IC免疫小鼠脾细胞的 10倍 ;IC pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞IL 4mRNA转录水平亦高于其他免疫组 ,其IL 4mRNA的T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的 2倍。结论 HBsAg 抗HBs 质粒DNA复合型疫苗在增强体液免疫应答的同时可诱导脾细胞IFN γ的表达水平增高。