糖组学研究技术进展及其意义

糖组学(glycomics)是研究糖链组成及其功能的一门新学科,近年来备受关注。该文对糖组学的研究背景、意义、策略、技术手段以及在肿瘤学中的应用前景进行综述。

STAT3在肝癌中发挥致癌和抑癌双重作用

研究发现,在不同类型肿瘤中均存在STAT信号通路的过度激活。在STAT信号通路中,通过细胞外配体包括细胞因子、激素和生长因子,特异性结合受体,进而激活Janus酪氨酸激活酶（包括Jak1,Jak2,Jak3和Tyk2）。酪氨酸激活酶可对每个Stat蛋白酪氨酸的残端磷酸化。同样,非受体激活型酪氨酸激活酶（例如c-ABL和c-SRC）,可不通过受配体信号的激活,

人肝癌细胞系Slit／Robo启动子甲基化状态及基因表达的研究

目的研究Slit／Robo信号通路相关基因Slit1、Slit2、Slit3和Robo1、Robo3在多种人肝癌细胞系中的表达及甲基化状态，探讨与肝癌发生和发展的关系。方法提取9种人肝细胞癌细胞株（Hep3B、HepG2、PLC／PRF／5／PRF／5、SMMC7721、BEL-7402、MHCC97-H、MHCC97-L，LM3、LM6）及对照细胞株L02的基因组DNA和总RNA，采用半定量逆转录聚合酶链反应技术和甲基化特异性聚合酶链反应技术检测Slit1、Slit2、Slit3和Rob01、Rob03基因的基因表达水平与启动子甲基化状态。实验数据应用Pairedf检验。结果Slit1、Slit2、Slit3基因除个别细胞株外，在不同转移潜能细胞株中均发生了DNA甲基化，同时Slit1和Slit3在mRNA水平几乎均不表达，Slit2基因表达程度在不同转移潜能的细胞株之间存在差异，随着转移潜能的增加表达大致呈下降趋势。作为Slit2受体的Robol基因在10株肝癌细胞株中均发生甲基化修饰，但除在SMMC7721、BEL-7402、L02不表达外，其余7种细胞株均有表达。Rob03基因相关CpG岛在9种肝癌细胞株中均未发生甲基化，同时其在mRNA水平均无表达。结论Slit／Robo可能在肝癌发生和发展中发挥作用。而Robo3则在肝癌中不发生表达而且其表达沉默可能不受甲基化方式调控。

凝集素芯片及其应用进展

凝集素芯片是糖组学研究的一项新技术。现就凝集素芯片的研究背景、原理、制备、应用和前景进行综述。

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中癌前病变阶段差异表达蛋白质的筛选

目的通过比较二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝细胞癌发生过程中不同阶段的蛋白质表达谱，筛选在大鼠肝癌前病变阶段起重要作用的蛋白质分子。方法大鼠分为DEN组和正常对照组，诱癌过程中定期处死动物并取其肝组织；以γ-谷氨酰转肽酶染色阳性的肝细胞增生灶为标志，识别和获取肝癌前病变的组织标本。用双向电泳及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法对大鼠正常肝组织、癌前病变组织和肝癌组织的全蛋白质组表达谱进行比较和鉴定。用Western blot和RT—PCR方法对部分差异表达蛋白质（如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶）进行表达水平的验证。结果筛选出表达水平差异≥2倍的蛋白质共82种，其中在癌前病变阶段即发生明显改变的差异表达蛋白质有47种，包括在正常对照组、癌前病变组、肝癌组呈现依次上调的层黏连蛋白受体1等8种蛋白质和在上述组织中呈现依次下调的鲱精胺酶等22种蛋白质。Western blot和RT—PCR方法对层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶表达水平的验证结果与双向电泳的结果相似。结论大鼠肝癌形成过程中不同阶段的蛋白质表达谱有所不同；对癌前病变的差异表达蛋白质如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶等进行深入探讨，有望为人类肝癌的早期诊断和治疗提供线索。

黄曲霉毒素B_1诱发树鼩肝癌过程中的差异表达蛋白质分析及意义

目的比较黄曲霉毒素B1(AFB1)诱发的树鼩肝细胞癌生长不同阶段的蛋白质表达谱的改变,筛查在AFB1诱发的肝癌发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子。方法用双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)对同一动物自身的癌发生前肝组织(A45W),癌发生后的肝癌组织(ACa)及未经AFB1处理的对照组动物肝组织(E45W)进行了相互比较。结果A45W组、ACa组、E45W组分别平均检测到(1255±43)个蛋白点(n=3)、(1198±50)个蛋白点(n=3),和(1252±40)个蛋白点(n=3),以其中A45W组图谱为参考胶,ACa组、E45W组分别与其匹配的平均匹配点数为(818±39)个(n=3)和(777±45)个(n=3),平均匹配率分别为66%和62%。癌与癌前比(ACavsA45W),相差2倍以上的上调点和下调点分别为108个(包括癌特异点)和75个;癌前与未经AFB1处理的对照组比(A45WvsE45W),相差2倍以上的上调点有78个,下调点有21个。质谱可鉴定出不均一核糖核蛋白A1、不均一核糖核酸核蛋白A2/B1、peroxiredoxin1、peroxiredoxin2、膜联蛋白4、肌球蛋白α链等26种胶内差异蛋白质。结论在AFB1诱发的树鼩肝癌发生不同阶段有明显的差异性蛋白表达谱,为进一步对人肝癌蛋白质组的研究提供了线索。

Stathmin对肝癌细胞HCCLM3增殖及其肿瘤相关基因表达的影响

目的探讨人stathmin基因在肝癌发生、发展过程中的作用及其机制。方法化学合成stathmin序列特异性小干扰RNA，用脂质体Lipofectamine^TM2000转染人肝癌细胞株HCCLM3细胞。采用RT-PCR和Western blot技术检测stathmin的RNA干扰效率；用细胞计数试剂检测干扰细胞的生长增殖情况；用膜联蛋白V／碘化丙啶双标记流式细胞术检测细胞凋亡；并用荧光定量PCR检测肿瘤增殖凋亡的相关基因。均数两两比较用配对t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。结果RNA干扰HCCLM3细胞后，stathmin的表达被显著抑制（P〈0．05），抑制率达90％；在RNA干扰24、48h和72h时，HCCLM3细胞的增殖抑制率分别为13．04％±0．10％、28．10％±0．41％和37．36％±2．15％（F=4．21，P〈0．05）；RNA干扰后，细胞凋亡比例从9．20％±0．64％上升至25．11％±1．62％（F=44．67，P〈0．01）；且RNA干扰组细胞癌基因c-myc、c-fos和增殖相关基因ki-67的mRNA表达水平明显下降，促凋亡基因caspase-3、bax和p53的mRNA表达水平升高（P值均〈0．05）。结论stathmin可能通过调节肿瘤增殖相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，参与肝癌的发生和发展进程。

醛酮还原酶1B10基因沉默对MHCC97H细胞生长和基因表达的影响

目的 探讨醛酮还原酶1B10（AKR1B10）基因在肝癌发生和发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成AKR1B10序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectaminrTM2000介导转染人肝癌细胞系MHCC97H,设实验组转染AKR1B10-小干扰RNA,设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA,设空白对照组不作转染.用实时定量PCR、Western blot和酶活性检测法检测AKR1B10 mRNA和蛋白的表达情况,用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染细胞的生长增殖变化,用流式细胞仪检测膜联蛋白V/碘化丙啶双标记的凋亡细胞变化,并用实时定量PCR检测c myc、c-fos、N-ras、ki-67、caspas 3、bax肿瘤相关基因的表达变化.用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较,LSD法进行多重比较.结果 转染24、48 h和72 h后,AKR1B10 mRNA的相对表达量在实验组分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032;阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794＋0.105;空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067.不同转染时间和不同实验组中AKR1B10 mRNA的表达比较,F值分别为11.650和566.971,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10mRNA表达较空白对照组被明显抑制,抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4%和63.7%±6.1%,以转染48 h的抑制率最高（t=80.68,P＜0.01）;阴性对照组的表达水平接近空白对照组（P＞0.05）.Western blot结果显示,转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降,其中以转染72 h的降低幅度最大;阴性对照组的表达水平接近空白对照组.转染24、48、72h和96h后,实验组450nm处吸光度值分别为1.465±0.040、1.724±0.106、1.934±0.069和2.377±0.163;阴性对照组分别为1.528±0.044、2.019±0.091、2.711±0.204、3.151±0.159;空白对照组分别为1.567＋0.057、2.102±0.099、2.642±0.198、3.069±0.180;不同转染时间和不同实验组间比较,F值分别为128.092、36.535,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染了AKR1B10-siRNA的MHCC97H细胞生长受到抑制.与空白对照组相比,实验组的细胞生长抑制率在转染48、72 h和96 h分别为18.0%±1.6%、26.1%±3.2%和22.5%±1.1%,t值分别为19.197、13.093和23.553,P值均＜0.01,差异均有统计学意义;阴性对照组的细胞生长未受到明显抑制（P＞0.05）.实验组、阴性对照组和空白对照组各基因mRNA的相对表达量：c-myc基因分别为1.047±0.156、1.737±0.193和1.631±0.128;c-fos基因分别为0.041＋0.003、0.082±0.006和0.081±0.004; N-ras基因分别为0.082±0.009、0.156±0.013和0.133±0.015;ki-67基因分别为0.032±0.002、0.070±0.008和0.069±0.005; caspasc-3基因分别为0.148±0.018、0.110±0.009和0.108＋0.012;bax基因分别为0.780±0.092、0.629±0.058和0.617±0.073,各基因的mRNA在不同组别表达差异均有统计学意义（F值分别为104.384、400.915、211.903、427.041、67.750和37.272,P值均＜0.01）.结论 AKR1B10可能通过调节肿瘤相关基因的表达水平来促进细胞增殖、抑制细胞凋亡.

用双向凝胶电泳-飞行时间质谱技术分析HBV感染肝组织蛋白质组

目的比较正常肝组织与HBV感染肝组织中蛋白质表达谱的改变,筛查在HBV致病过程中相关蛋白质分子表达的不同。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,对3例正常肝组织(A组),3例HBV感染肝组织(B组,均为组织HBsAg阳性,外周血HBsAg阳性、抗-HBe阳性、抗-HBc阳性)的蛋白质组表达谱进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果相同条件下对各组总蛋白样品分别进行3次双向电泳,各组检测到的蛋白点数如下:A组(1125±56)个,B组(1203±42)个。以各组中2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶,分别进行2组间的匹配分析,筛选出两组之间差异大于或等于2倍的蛋白点40个。应用质谱鉴定出人线粒体醛脱氢酶H链、结合珠蛋白Hp2、抗过氧化物蛋白2等22种蛋白质。结论HBV感染所致慢性炎症能使肝组织表现出明显的差异性蛋白表达谱。

左炔诺孕酮紧急避孕失败后继续妊娠者胎盘微观形态和性激素受体及增殖核抗原Ki67和凋亡相关分子caspase-3/8/9的表达

目的:明确左炔诺孕酮紧急避孕(LNG-EC)暴露是否对妊娠晚期胎盘产生相关影响。方法:选择21例末次月经后使用过LNG-EC药孕妇计划剖宫产的产后胎盘为研究组,21例正常妊娠孕产妇计划剖宫产的产后胎盘为对照组。采用电子显微镜观察胎盘绒毛和细胞器超微结构;采用免疫组织化学方法检测孕妇胎盘中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、雄激素受体(AR)和增殖核抗原Ki67、凋亡相关分子caspase-3/8/9的表达情况。结果:光学显微镜和电子显微镜下胎盘形态学组间无统计学差异(P>0.05);胎盘中ER、PR、AR、Ki67和caspase-3/8/9的表达组间无显著统计学差异(P>0.05)。结论:左炔诺孕酮用于紧急避孕不影响其失败后妊娠晚期胎盘的形态结构、性激素受体表达和胎盘增殖及老化。

白细胞介素2受体拮抗剂对肝移植后新发糖尿病发病及其转归的影响

目的探讨白细胞介素2受体拮抗剂（interleukin-2 receptor antagonists, IL-2Ra）在肝移植受者中对移植后新发糖尿病（newly-onset diabetes after transplantation, NODAT）发病及其转归的影响。 方法回顾性调查2001年4月至2016年12月在我院肝外科接受同种异体肝移植术的879例患者的术前及术后临床资料，按照术后是否应用IL-2Ra将其分为IL-2Ra使用组和未使用组；按照NODAT是否发生逆转将其分为暂时性NODAT（Transient-NODAT，T-NODAT）和持续性NODAT（Persistent-NODAT，P-NODAT）；并分析IL-2Ra对NODAT、T-NODAT累计发病率及其发病风险的影响，进一步探讨IL-2Ra对肝移植NDOAT患者远期生存的影响。 结果共入组879例肝移植受者，IL-2Ra使用组（549人）共计177人（32.24%）发生NODAT，其中29.38%（52人）发生逆转；未使用组（330人）共计131人（39.70%）发生NODAT，其中26.72%（35人）发生逆转。校正18项相关混杂因素后分析发现，IL-2Ra使用组的NODAT累计发病率显著低于未使用组（校正后P＝0.028），且IL-2Ra是肝移植NODAT发病的独立保护因素（HR＝0.774, 95%CI 0.616～0.973, P＝0.028）；而使用IL-2Ra与否与肝移植NODAT患者的逆转情况并无显著联系。IL-2Ra使用组NODAT患者的生存情况显著优于未使用组（校正后P＝0.001）。 结论使用IL-2Ra可显著降低肝移植受者发生NODAT的风险，并且显著改善肝移植NODAT患者的远期生存。

运用表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术建立结直肠癌预测诊断模型

目的寻找与结直肠癌相关的蛋白质并建立结直肠癌血清蛋白指纹图谱诊断预测模型。方法随机选取结直肠癌病例36例（结直肠癌组）和疝或行胆囊择期手术的患者36例（对照组），术前静脉采血，采用弱阳离子交换蛋白质芯片（CM10），经表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱（SELDI—TOF—MS）技术测定，建立结直肠癌的血清蛋白指纹图谱诊断预测模型；选取88例结直肠癌患者和44例正常对照进行盲法验证。结果通过两组比较，得到5个差异蛋白峰，并以此建立诊断预测模型，其敏感性为100％，特异性为97．2％。盲法验证显示敏感性为71．6％，特异性为72．7％。其中质荷比为8908与13707的蛋白均存在于结直肠癌组和正常组的比较中，提示上述蛋白质与结直肠癌相关。结论运用SELDI—TOF—MS技术建立的血清蛋白指纹图谱模型对诊断结直肠癌具有较高的敏感性与特异性。质荷比为8908与13707的蛋白可能成为结直肠癌的肿瘤标记物。

抗HBV治疗后血清学转换中血清糖蛋白聚糖谱的变化及其临床意义

目的 探索慢性乙型肝炎患者经抗病毒治疗后HBeAg和HBsAg血清学转换过程中血清糖蛋白聚糖谱的特征性改变,并探讨其生物学意义.方法 在去除高丰度蛋白质的基础上,应用凝集素芯片技术比较分析正常对照组、HBeAg阳性非治疗组、HBeAg转换治疗组、HBsAg阴转治疗组的血清糖蛋白聚糖亲和谱,并用凝集素印迹方法验证芯片结果.计量资料采用单因素方差分析,进而进行Student-Newman-keuls （SNK）法两两比较.结果 HBeAg阳性非治疗组与正常对照组相比,对16种凝集素的亲和荧光明显减弱（P值均＜0.05）,提示在HBV活跃复制的HBeAg阳性非治疗组患者的血清糖蛋白聚糖谱中末端和核心岩藻糖、黏蛋白T/Tn抗原、α-N乙酰半乳糖胺（GalNac α）、末端β 1-4和β-D链接半乳糖、N-乙酰葡糖胺（GlcNac）、平分型GlcNac、甘露糖、唾液酸糖链结构明显降低.HBeAg转换治疗组与HBeAg阳性非治疗组相比,包括豌豆凝集素、桑橙凝集素和上述16种凝集素对血清糖蛋白聚糖的亲和荧光增强（P值均＜ 0.05）,说明降低的这些血清糖蛋白聚糖结构又恢复到或略高于对照组水平.HBsAg阴转治疗组与HBeAg转换治疗组相比,血清糖蛋白聚糖对橙黄网孢盘菌凝集素、尾穗苋凝集素、螺旋蜗牛凝集素、螺旋圆口螺凝集素、蓖麻凝集素、番茄凝集素、茄块茎凝集素、红腰豆凝集素、眼镜蛇罗非鱼凝集素和红花菜豆凝集素结合的亲和下降,接近对照组（P值均＜0.05）,提示血清糖蛋白中末端岩藻糖、GalNacα、末端β 1-4链接半乳糖、平分型GlcNac等结构下降到接近对照组水平;而对凝集素槲寄生凝集素、扁豆凝集素、雪花莲凝集素、豌豆凝集素、桑橙凝集素和木菠萝凝集素的亲和荧光增强（P＜ 0.05）,提示末端β-D-半乳糖残基、核心岩藻糖结构在HBsAg阴转治疗组明显增多.结论 血清糖蛋白聚糖变化与HBeAg和HBsAg血清学转换密切相关.核心岩藻糖、末端β-D-半乳糖残基结构可作为抗HBV治疗后HBsAg阴转相关的糖标志物.