电化学发光免疫分析24小时尿游离皮质醇的方法学验证

目的 应用电化学发光免疫分析法（ECLIA）和化学发光免疫测定法（CUA）测定24小时尿游离皮质醇（UFC）,比较方法的相关性,拟用ECLIA替代CLIA检测UFC,并对ECLIA进行系统评价及建立本实验室的参考区间.方法 采用ECLIA萃取法和CLIA萃取法检测24例住院患者24小时尿液,对其结果进行相关性比较.收集87例正常人24小时尿液,用ECLIA检测其尿中游离皮质醇含量,建立参考区间,验证其系统性能,包括精密度、功能灵敏度和分析测量线性范围.结果 ECLIA萃取法和CLIA萃取法比较r=0.9724,P＜0.001,两者有相关性;ECLIA萃取法批内差异高值3.30％,低值4.52％,批间差异高值4.69％,低值6.55％;分析测量范围：0.053 ～ 58.91 μg/dL,R2=0.9882,y=1.0344X＋0.8466;功能灵敏度为0.05μg/dL;以第97.5％位数为参考上限,第2.5％位数为参考下限,建立的参考区间为30.1 ～129.1 μg/24h.结论 ECLIA萃取法具有合适的精密度、线性,可准确反映机体24小时尿游离皮质醇的分泌情况.

耐万古霉素肠球菌的基因检测

目的 调查上海华山医院2007-2009年间VRE的分离率,并对耐药菌株的分子特性进行研究,为本地区VRE的预防和控制提供有价值的信息.方法 通过琼脂平板稀释法（ADSP）从临床鉴定的890株肠球菌中筛选VRE菌株,并通过微量肉汤稀释实验测其对万古霉素及替考拉宁的MIC;采用PCR及测序方法检测万古霉素耐药基因以及可能毒力基因esp,hyl;运用MLST对VRE进行克隆分型并通过PFGE分型技术进行验证.结果 ADSP法及微量肉汤稀释实验共筛选出13株VRE菌株.其中6株VRE（2007-2008年）只对万古霉素耐药,但对于替考拉宁敏感（万古霉素MIC64～256μg/ml）;耐药基因PCR产物测序结果提示这6株VRE均携带同一种可能导致万古霉素耐药的新型基因,该基因序列与已报道的耐药基因均不同;MLST及PFGE分型提示其属于不同型别.另外7株VRE（2009年1-7月）对万古霉素和替考拉宁的MIC结果分别为32～64μg/ml和16～32 μg/ml,耐药基因检测均为vanA.MLST分型结果提示13株VRE共分为4个不同的ST型,其中11株均属克隆复合型CC-17.13株VRE毒力基因esp和hyl的阳性率分别为69.2%和30.8%.结论 上海华山医院VRE克隆分型以CC17为主,同时发现上海华山医院存在一种可能导致万古霉素耐药的新型基因介导的VRE,该新基因的功能和定位尚待进一步研究.

利用EZ-Tn5转座子插入突变探索细菌基因组中影响其耐药性变化的因素

目的研究细菌基因组中影响抗菌药物活性的因素。方法用EZ-Tn5转座复合物通过电转化,随机插入大肠埃希菌BL21细菌染色体基因组,获得BL21菌株的插入突变文库;对所有突变克隆株进行37种抗菌药物体外药敏试验;耐药性发生明显恒定改变的菌株进行反向PCR,并对产物进行测序和序列分析,确定转座子插入的确切位点;结合被灭活基因的表达功能推测耐药性改变的原因。结果确定大肠埃希菌电转化最佳条件为菌液OD值为0.8(600 nm)时进行感受态制备,10%甘油缓冲体系和2.7 V电击电压;共得到182株成功插入Tn5转座子的克隆,建立大肠埃希菌BL21菌株随机插入突变文库,其中插入突变菌株BLmu29对青霉素、头孢唑林、头孢克洛、头孢丙烯等抗菌药物的敏感性增加,其中以对青霉素的变化最为明显,抑菌圈直径从对照菌株的12 mm扩大到17 mm;对其进行反向PCR,并对PCR产物测序证实插入转座子的位点为1736,其灭活的基因为甘油-3-磷酸酰基转移酶。结论灭活大肠埃希菌基因组中甘油-3-磷酸酰基转移酶所对应基因,使对细菌对青霉素等亲水性抗菌药物的耐药表型发生改变,提示此基因可影响大肠埃希菌对于亲水性抗菌药物的耐药性。