国产重组人尿激酶原治疗ST段抬高性急性心肌梗死41例

目的: 观察国产重组人尿激酶原(rhPro-uk)在急性ST段抬高性心肌梗死溶栓治疗中的安全性和疗效.方法: 发病6 h以内ST段抬高的急性心肌梗死(AMI)患者41例按2∶1分组,28例给予rhPro-uk 30～60 mg溶栓治疗,13例应用国产尿激酶(UK)150万U溶栓对照治疗,观察溶栓再通率、并发症以及不良反应发生率.结果: rhPro-uk组溶栓后90 min冠脉开通达TIMI-3级者明显高于UK组(57% vs 23%,P<0.05).ST段回落>50%发生率rhPro-uk组高于UK组(75% vs 39%,P<0.05).不良反应发生率: rhPro-uk组出血6例(22%),UK组出血3例(23%),无1例发生颅内出血或大出血需输血治疗,全部无过敏反应发生.结论: AMI患者rhPro-uk溶栓治疗是有效和安全的.

抗菌肽Pexiganan和IB-367的基因克隆及表达

目的:为开发新的抗菌药,通过基因工程手段获得能够表达抗菌肽Pexiganan和IB-367的工程菌株。方法:人工合成2种抗菌肽Pexiganan和IB-367基因,构建相应的GST融合表达载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆,通过SDS-PAGE和Western印迹验证目的蛋白的表达。结果:获得了2株分别表达Pexiganan-GST融合蛋白和IB-367-GST融合蛋白的工程菌株。结论:通过基因工程方法,可以融合蛋白的形式获得小分子多肽Pexiganan和IB-367。

重组人尿激酶原治疗急性ST段抬高性心肌梗死的多中心Ⅲ期临床试验

目的比较尿激酶原和尿激酶溶栓后的开通率和安全性。方法采用随机、单盲、阳性药对照多中心临床试验。尿激酶原用量为50mg(n=110)和60mg(n=115),尿激酶用量150万U(n=103)。用冠脉造影观察溶栓后90min梗死相关冠状动脉的开通率,并检测患者的各项体征和生化指标,观察14天内病死率、颅内出血率及其他不良反应。结果溶栓后90min,尿激酶原50mg组的TIMI 2+3级开通率为78.50%,TIMI 3级为60.75%;60mg组分别为72.73%和56.36%,均高于尿激酶的开通率51.58%和36.84%,具有显著的统计学差异。50mg组和60mg组之间比较则无统计学差异。同时证明尿激酶原在病死率、颅内出血率及其他不良反应方面均好于尿激酶。结论尿激酶原溶栓后的冠脉开通率和安全性均优于尿激酶,是一种更为理想的溶栓新药。

通脉愈伤胶囊抗炎镇痛作用的实验研究

目的研究通脉愈伤胶囊的镇痛、抗炎作用。方法采用二甲苯造成小鼠急性炎症模型,角叉菜胶、皮下包埋棉球法分别造成大鼠急、慢性炎症模型。采用热板法、腹腔注射醋酸法造成疼痛模型;将实验动物分为5组:空白对照组,阳性对照云南白药胶囊组,高、中、低剂量通脉愈伤胶囊组。以考察通脉愈伤胶囊的抗炎、镇痛效果。结果通脉愈伤胶囊能显著降低小鼠毛细血管通透性,减少炎性介质的渗出;明显抑制由二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀及角叉菜胶所致的大鼠炎症反应,降低白细胞数目;对大鼠肉芽组织增生也有显著的抑制作用。通脉愈伤胶囊能提高小鼠痛阈,延长镇痛潜伏期,降低扭体次数,镇痛率分别为49.6%、43.5%、33.3%。结论通脉愈伤胶囊具有良好的抗炎、镇痛作用。

用高效液相色谱测定重组人尿激酶原制剂的蛋白含量

目的:用RP-HPLC方法对注射用重组人尿激酶原制剂蛋白含量进行定量分析。方法:用反相C18柱、0.1%TFA水溶液与0.1%乙腈进行梯度洗脱,280nm波长紫外检测器监测;以重组人尿激酶原同质标准品作为对照品,根据进样量和相应的峰面积建立标准曲线方程,将待测定样品的峰面积代入标准曲线方程,可测得蛋白含量。结果:按照方法学验证要求对此方法进行了专属性、检测限、定量限、线形、精密度(重复性、中间精密度)、准确度(回收率)考察,线性范围为9～27μg,回收率在97%以上,RSD<2.0%,完全满足对制剂蛋白的定量需求。结论:本方法准确,适用于注射用重组人尿激酶原成品制剂蛋白定量测定。

重组人尿激酶原纯化工艺病毒去除效果验证

目的验证重组人尿激酶原(Prourokinase,Pro-uk)纯化工艺的病毒去除效果。方法采用模拟Pro-uk纯化工艺中阴离子和阳离子交换层析的scale-down模型,以水泡性口炎病毒(Vesivular stomatitis virus,VSV)、脑心肌炎病毒(Encephalo-myocarditis virus,EMCV)、人单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type-1,HSV-1)为指示病毒,采用细胞病变法评价离子交换层析的病毒去除效果。结果阴离子交换层析对脂包膜病毒VSV和HSV-1的去除能力强,对无脂包膜病毒EMCV的去除能力较弱;阳离子交换层析对VSV和HSV-1的去除能力较弱,对EMCV的去除能力较强。经离子交换层析纯化后,3种指示病毒的累计去除效率均>99.99%(大于4 log10)。结论 Pro-uk纯化工艺中的离子交换层析是控制病毒安全性的有效步骤,其去除效率达到了《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》规定的安全标准。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9单克隆抗体抗原结合活性间接ELISA测定方法的建立

目的建立前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)单克隆抗体抗原结合活性的间接ELISA测定方法。方法利用链酶亲和素-生物素系统捕获包被PCSK9蛋白,采用间接ELISA法检测PCSK9单抗参比品和供试品,通过拟合四参数方程Y=(A-D)/[1+(X/C)~B]+D,得出两者的半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC_(50)),计算供试品的抗原结合活性。同时验证该方法的专属性和精密性。结果 PCSK9单抗参比品、供试品及Evolocumab(Amgen)的曲线均呈显著的剂量依赖关系,符合四参数方程,且R^2>0.99;抗CD115抗体及空白稀释液不存在类似的剂量效应曲线;重复性、人员及日间精密性的相对标准偏差(relative standard deviatin,RSD)分别为7.5%、11.3%和10.4%,均<15%。结论成功建立了抗PCSK9单抗抗原结合活性的间接ELISA检测方法,该方法专属性和精密度良好,可用于PCSK9单抗抗原结合活性的常规测定。

抗CD20抗体高产细胞株的筛选及质量评估

目的：筛选高表达单克隆细胞株,并通过优化培养基及流加物,最终达到提高目的蛋白产量及质量的目的。方法：通过有限稀释法对转染目的蛋白的CHO-S细胞进行单克隆化,应用双抗夹心ELISA方法对单克隆细胞株抗体表达量进行初步评估,最后根据筛选细胞株的活率、密度、产量及代谢情况,选择2~3株单克隆细胞进行培养条件优化,并对获得的发酵液进行纯化捕获,根据抗体蛋白表达量、糖型、等电点、纯度、酸碱峰分布等进行相应的评估分析,筛选出最优细胞株及最优培养方案。结果：经过单克隆化处理以及培养条件优化,蛋白的表达量由初始的不到500mg/L提升到2 290mg/L,且抗体蛋白纯度高达97.48%。抗体蛋白质量分析结果显示B1方案为该实验最优培养方案。结论：通过细胞株筛选、培养基优化能显著提高抗体蛋白的产量及质量,同时对抗体蛋白糖型、等电点、纯度等均有一定程度的优化。因此工业生产中可以通过高表达克隆的筛选、培养工艺优化等对目的蛋白产量及质量进行一定程度的改善与提高,对后期实验研究及工业化方案开发都具有很好的指导意义。