两种方法对上海及周边地区实验大小鼠螺杆菌携带情况的调查

目的了解上海及周边地区实验小鼠、大鼠螺杆菌携带情况,为我国实验动物等级及监测标准的制定提供参考和依据。方法 PCR法共检测了352只小鼠(清洁级101只,SPF级251只),101只大鼠(清洁级69只,SPF级32只);ELISA法共检测了88只小鼠(清洁级26只,SPF级62只),165只大鼠(清洁级84只,SPF级81只);并对其中88只小鼠、101只大鼠的PCR和ELISA法阳性检测率进行比较。结果 PCR法检测小鼠平均阳性率为35.8%(126/352),清洁级阳性率为51.5%(52/101),SPF级阳性率为29.5%(74/251);大鼠平均阳性率为70.3%(71/101),清洁级阳性率为69.6%(48/69),SPF级阳性率为71.9%(23/32);ELISA法检测小鼠平均阳性率为15.9%(14/88),清洁级阳性率为19.2%(5/26),SPF级阳性率为14.5%(9/62);大鼠平均阳性率为52.7%(87/165),清洁级53.6%(45/84),SPF级51.9%(42/81);88只小鼠PCR法阳性检测率为72.7%(64/88),ELISA法阳性检测率为15.9%(14/88);101只大鼠PCR法阳性检测率为70.3%(71/101),ELISA法阳性检测率为49.5%(50/101)。结论上海及周边地区实验大鼠、小鼠中皆存在着不同程度的螺杆菌感染,两种方法阳性检出率比较结果表明回盲部内容物PCR法较检测血清中抗螺杆菌抗体ELISA法更为敏感。

实验大鼠和小鼠绿脓杆菌分离株的鉴定和血清分型研究

目的了解上海、江苏实验大鼠和小鼠绿脓杆菌的感染状况及血清型分布情况。方法 2013年7月—2015年5月,从上海、江苏59个实验动物设施采集实验大鼠和小鼠的回盲部内容物进行绿脓杆菌分离、细菌形态、生化特性、16S rRNA基因序列和血清型分析。结果从20个设施分离到67株绿脓杆菌,生化鉴定和PCR试验结果均符合绿脓杆菌特征。血清型分析显示E型(17株,占25.4%)和B型(14株,占20.9%)为主要血清型。结论本地区实验大鼠和小鼠存在绿脓杆菌感染,血清型分布较分散,无明显的流行特征。

实验大鼠和小鼠多种细菌PCR检测与分析

目的调查上海市实验动物生产设施大鼠、小鼠细菌携带状况。方法比较国内外实验动物细菌监测方案,选取螺杆菌、啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌作为检测项目,分别于2014年和2016年收集样品共计848份,采用PCR方法对上述6种病原体进行检测。结果 SPF级设施均无金黄色葡萄球菌污染,清洁级设施2014年无肺炎克雷伯杆菌污染,其它病原体在不同级别设施内均有不同程度的污染,所有清洁级设施均存在螺杆菌和牛棒状杆菌污染。螺杆菌、啮齿柠檬酸杆菌和牛棒状杆菌在不同级别动物上均检出阳性。螺杆菌、绿脓杆菌阳性率呈下降趋势,而啮齿柠檬酸杆菌、牛棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌阳性率则呈上升趋势。结论本研究全面、系统地分析了上海地区实验大鼠、小鼠细菌携带状况,为提高实验动物质量和饲养管理水平起促进作用,为我国实验动物国家标准的修订和完善提供依据和参考。

高通量测序技术分析无特定病原体级实验小鼠肠道的菌群组成

目的:应用高通量测序技术检测无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级实验小鼠肠道的菌群组成,分析其细菌携带状况。方法:应用高通量测序技术,对14个品系共65只SPF级实验小鼠的回盲部肠道内容物样本中细菌16S r RNA V3~V4区进行深度测序,分析样本的菌群组成、丰度和Alpha多样性,并在属水平上筛选葡萄球菌属、假单胞菌属、支原体和棒状杆菌属。结果:65只SPF级健康成年小鼠的肠道内容物样本经数据过滤和质控后,共得到144 318条高质量序列用于后续分析,结果提示相同品系样品间菌群丰度表现出明显的差异。所有样本的序列主要集中在以下8个门,依次为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、Saccharibacteria、软壁菌门(Tenericutes)和螺旋菌门(Spirochaetae)。在属水平上检测到了葡萄球菌属、假单胞菌属、支原体和棒状杆菌属。结论:相同品系的SPF级实验小鼠肠道菌群在物种组成、丰度及Alpha多样性方面也会表现出显著差异,有必要致力于研究各种方法以使实验动物的肠道菌群在可控和可监测范围内,高通量测序技术提供了这一可能。

啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法。方法根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的条带。最佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,引物浓度为0.625μmol/L。在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg。结论本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础。

实验大鼠泰泽病原体三种检测方法的比较

目的 利用不同的检测方法调查了解我国实验大鼠中泰泽病原体的携带情况,并比较三种方法的检测结果,为合理选择实验室检测方法提供依据.方法 应用ELISA法,间接免疫荧光（IFA）法和套式PCR法三种检测方法对国内大型实验动物生产厂家送检的125只实验大鼠同时进行泰泽病原体检测,并对比分析检测结果,评估我国实验大鼠泰泽病原体的携带情况.结果 共检测125只实验大鼠,其中清洁级54只,SPF级71只,IFA法检出36只阳性,89只阴性,阳性检出率28.8%：ELISA法检出24只阳性,101只阴性,阳性检出率19.2%：PCR法检出6只阳性,119只阴性,阳性检出率4.8%;ELIsA法和IFA法阳性检出率要高于PCR法.结论 对于泰泽病原体的检测,可以采用IFA法或ELISA法进行抗体检测,对可疑的样品用PCR法验证.相比而言,IFA法具有简单,可靠、价格低廉的优点,可以用于实验大鼠泰泽病原体感染状况的初步调查和流行病学监测.

培养法和 PCR法用于实验大、小鼠细菌检测的比较分析

目的比较培养法和PCR法对实验大、小鼠的细菌检测效果。方法分别采用传统细菌分离培养结合生化鉴定方法和PCR方法,对78只SPF级大鼠和422只SPF级小鼠进行检测,对两种方法的检测结果进行比较分析。结果 78只SPF级大鼠均未检测出阳性。422只SPF级小鼠,培养法检测阳性率7.11%(30/422),其中金黄色葡萄球菌10只,绿脓杆菌22只,肺炎克雷伯杆菌2只。PCR法检测阳性率7.58%(32/422),其中金黄色葡萄球菌10只,绿脓杆菌25只,肺炎克雷伯杆菌2只。结论 PCR法的敏感性高于培养法,操作简便、快捷,适用于实验动物细菌的快速诊断和大规模的质量筛查。

大、小鼠绿脓杆菌脉冲场凝胶电泳分型研究

目的对近年来上海及江苏地区部分单位大、小鼠绿脓杆菌进行分离鉴定，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型技术作基因型分析，以了解绿脓杆菌流行菌株与宿主之间的相关性。方法无菌采集上海及江苏地区部分单位实验大、小鼠回盲部内容物进行绿脓杆菌分离培养，采用形态学观察、生化试验对分离菌进行鉴定。提取绿脓杆菌分离株基因组DNA，经XbaI酶切后进行脉冲场凝胶电泳。结果共分离到67株绿脓杆菌，PFGE图谱可分为39种不同带型，14个基因簇（A—N），优势簇分别为I、H、B和G，分别占17．9％（12／67）、14．9％（10／67）、13．4％（9／67）和11．9％（8／67）。同一来源地的分离株大多呈现不同的基因簇。结论67株细菌具有很大的基因多态性，呈散在分布，未见明显的流行特征。

螺杆菌属LAMP快速检测方法的研究

螺杆菌与人和动物多种疾病发生的相关性一直是国内外研究的热点之一,而各类螺杆菌感染日益引起人们的关注。为建立一种螺杆菌属通用的LAMP快速检测方法,根据螺杆菌属16S rRNA基因序列保守区域设计一组特异性引物,进行条件优化、特异性和敏感性试验。结果表明:在65℃反应60 min的条件下建立的螺杆菌属LAMP扩增反应最佳,并呈良好特异性,未检测到其他常见细菌。灵敏度达3 pg·μL-1,与PCR结果无差异,但操作上更易于完成。该方法快速、准确、灵敏,可用于螺杆菌的快速检测。

肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立及初步应用

根据肝螺杆菌fla B基因保守区域设计一组特异性引物,经过条件优化、特异性和敏感性分析,成功建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP扩增方法仅能检测出肝螺杆菌,其他常见细菌未见特异性扩增。检出肝螺杆菌最低模板量为86.9fg/L,是普通PCR所需模板量的1/10。本研究建立的LAMP快速检测方法具备操作简单、特异性好、灵敏度高的优点,结果易于观察,对仪器设备要求低,适宜推广应用。

啮齿柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测啮齿柠檬酸杆菌(C.rodentium)esp B基因的方法,本研究根据Gen Bank中登录的C.rodentium esp B基因序列设计1对特异性引物,建立了C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,在102拷贝/μL^108拷贝/μL浓度范围内标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法仅对C.rodentium进行特异性扩增,而对牛棒状杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。其检测灵敏度可达24拷贝/μL。组内和组间试验变异系数均小于1%,重复性良好。临床样品初步应用结果显示,荧光定量PCR阳性检出率为56.36%(31/55),常规PCR阳性检出率为30.91%(17/55),二者符合率为74.55%。本研究建立的C.rodentium SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为实验动物C.rodentium的检测和流行病学调查提供了技术支撑。

牛棒状杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛棒状杆菌(C.bovis)环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法根据牛棒状杆菌16S rRNA基因保守区域设计一组特异性引物,对反应条件进行优化并对特异性和敏感性进行分析。结果建立的LAMP扩增方法仅能检测出牛棒状杆菌,其他常见细菌未见特异性扩增,检出牛棒状杆菌的最低模板量为118 fg/μL。结论建立的牛棒状杆菌LAMP检测方法操作简单、快速高效,结果易于观察,对仪器设备要求低,可用于牛棒状杆菌的快速检测。

PEPCK不同启动子调控报告基因表达效率的比较

目的构建两种不同的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控报告基因表达质粒,比较该启动子在各种细胞系中的表达效率。方法采用PCR克隆大鼠PEPCK启动子1323 bp和560 bp两条片段,将两个PEPCK启动子片段插入pGL4.26-Luc2报告质粒中,将重组质粒转染到肝脏细胞系和脂肪细胞系,以非脂肪或肝脏细胞系做对照,比较PEPCK驱动荧光素酶表达效率。结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL4.26-PEPCK-Luc2荧光素酶表达质粒构建成功,且能够在体外表达荧光素酶。结论两种同片段的PEPCK启动子在各细胞系中的表达效率差异无显著性。

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae）的三重PCR检测方法。根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验。结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368bp。最佳退火温度在56~59℃之间,引物浓度均为0.2μmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Mg2＋浓度为2.5mmol/L。3种细菌间无交叉反应。对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应。最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA。3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好。同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出。结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持。

仙台病毒核蛋白的原核表达及鉴定

本研究从一株鼠仙台病毒(Sendai virus,SeV)中扩增获得核蛋白(nucleocapsid protein,NP)基因,将其克隆入pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明:该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

大鼠、小鼠、豚鼠和兔螺杆菌携带情况调查

目的了解上海及周边地区大鼠、小鼠、豚鼠和兔螺杆菌携带情况。方法采集大鼠、小鼠、豚鼠回盲部内容物和兔粪便，抽提细菌基因组DNA，采用单重PCR和多重PCR方法进行螺杆菌检测。结果上述动物螺杆菌阳性率分别为50．5％（105／208）、37．9％（204／538）、36．7％（36／98）和4．9％（12／247）。Helicobacter．hepaticus、Hbil＆、H．rodentium三重PCR结果显示，实验用兔检测到H．hepaticus、H．bilis阳性。豚鼠阳性样本中检测到H．bilis、Hrodentium阳性。大鼠和小鼠样本中H．hepaticus、Hbil＆、H．rodentium均有阳性检出。结论上海及周边地区大鼠、小鼠、豚鼠和兔均存在不同程度的螺杆菌感染。