玉米赤霉烯酮降解酶在马克斯克鲁维酵母中的表达及高产菌株的诱变筛选

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌属霉菌产生的一种霉菌毒素,常见于霉变的玉米、小麦等谷物中.研究发现,来源于粉红黏帚霉(Gliocladium roseum)的α/β水解酶ZHD101能够断裂ZEN的内酯键,破坏ZEN的毒性.本文利用食品安全级的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)重组分泌表达了ZHD101,发酵液上清中的表达产物具有水解ZEN的活性.利用UV和^(60)Co-γ联合诱变方法,提高了ZHD101在马克斯克鲁维酵母中的表达水平.高效液相色谱(HPLC)分析表明,重组菌株分泌表达的ZHD101酶蛋白既能水解标准品ZEN,又能在较温和的条件下水解发霉玉米样本中的ZEN,结果表明该重组菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101,可应用于发霉玉米的脱毒处理.

结核分枝杆菌核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶过表达菌株的构建及分析

rim I基因编码的核糖体蛋白丙氨酸乙酰转移酶(ribosomal-protein-alanine acetyltransferase,RimI)为结核分枝杆菌GCN5相关N-乙酰转移酶家族成员,其在结核分枝杆菌中的生物学功能尚不十分清楚。为探索RimI的生物学特性及其对结核分枝杆菌致病性的影响,本研究以耻垢分枝杆菌为模式菌,构建过表达结核分枝杆菌rimI基因的重组菌株Msm∷pMV261-rimI。分别培养Msm∷pMV261-rimI菌株和对照Msm∷pMV261菌株,分析两者生长速率、菌落形态和生物膜形成的差异,以及耐受低氧、低pH值、H 2O 2、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)和0.05%~1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等逆环境的能力;并将两种菌株分别接种于鼠巨噬细胞RAW264.7,观察两者在巨噬细胞内的存活能力。结果表明,相较于对照菌株,过表达rimI的菌株在生长前中期速率降低,生物膜早期成膜变缓,但不影响生物膜的后期成熟。同时,过表达rimI的菌株抵抗低氧、低pH值、H 2O 2等逆环境的能力增强,在巨噬细胞内的存活能力增强。结果提示,rimI基因对分枝杆菌的生物膜形成、抗逆性及细胞内生存具有重要作用,可能与结核分枝杆菌的毒力密切相关。

犬细小病毒病毒样颗粒在马克斯克鲁维酵母中的表达及免疫原性研究

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性、高度接触性传染病,是目前影响犬类健康的最严重的传染病之一.疫苗免疫是预防并控制CPV传播的重要措施.本研究以马克斯克鲁维酵母作为表达宿主进行犬细小病毒VP2蛋白的重组表达.犬细小病毒VP2蛋白经密码子优化后,在马克斯克鲁维酵母中获得高效表达,表达量可达到2.4g/L.重组表达的VP2蛋白自我组装形成大小为20nm的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),经分子筛凝胶层析纯化的VLPs制成疫苗,注射免疫小鼠进49天后抗体滴度可达10 000以上,并诱导小鼠产生血凝抑制抗体,表明利用马克斯克鲁维酵母制备的VLPs疫苗具有较高的免疫原性.

微生物与发酵工艺对苹果酒品质影响的研究概述

苹果酒是世界第二大发酵果酒品类。中国作为世界第一大苹果生产国,苹果酒市场潜力巨大,但苹果原料、发酵菌种和生产工艺的标准体系还有待完善。文章综述了苹果品种、成熟度、发酵菌种和发酵工艺对苹果酒品质的影响。挥发性香气物质和非挥发性的糖、有机酸和多酚类物质是苹果酒的主要成分。酯类是苹果酒的主要香气成分,多酚对苹果酒的口感起重要作用。苹果原料、酵母菌种、发酵温度等对苹果酒的品质有显著影响。通过酿酒苹果品种的筛选、非酿酒酵母属酵母的开发和多菌种的混合发酵来提升苹果酒的风味多样性,将是苹果酒的研究热点。

基于文献和专利分析非葡萄酒类果酒技术领域发展现状

为了解非葡萄酒类果酒领域的研究现状与发展趋势,该文检索了Web of Science数据库和incoPat专利平台2000—2021年非葡萄酒类果酒相关的文献和专利,并进行了文献和专利数据的可视化分析。非葡萄酒类果酒研究文献中,苹果酒文献发表量居第一位,主要研究方向为苹果品系、发酵菌株、成分和功能性的探究。发酵对非葡萄酒类果酒感官品质的影响是最新的研究热点。专利可视化分析结果表明,苹果酒、桑葚酒和蓝莓酒的专利申请量分列前3位;中国非葡萄酒类果酒专利的申请量居全球首位,占比超过75%。非葡萄酒类果酒生产技术研究方向主要集中于酿造工艺和微生物菌株。

马克斯克鲁维酵母表达系统菊粉酶启动子的改造及活性研究

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为一种食品安全级酵母,具有生长快,生物量高等特点,是一种新型的重组蛋白表达的宿主系统.启动子是供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列,调控着转录的起始过程,直接影响基因的表达水平.本文通过易错PCR技术对马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子Pinu进行两轮突变,以阿魏酸酯酶(Est1E)作为报告基因,经筛选、鉴定获得了5个可以显著提高外源蛋白表达量的突变型启动子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47,报告蛋白Est1E的酶活性是启动子改造前的2.31,2.65,5.01,5.40,5.43倍.随后测试了启动子Pm2X47对外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表达的影响,结果显示这两种酶的表达量均有提高,分别是启动子改造前的3.57倍和4.13倍.上述结果提示,改造后的菊粉酶启动子在提高外源蛋白表达水平方面具有一定的通用性,可作为新型候选表达元件,以提升马克斯克鲁维酵母重组表达外源蛋白的能力.

(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯类化合物的合成及其IDO抑制活性研究

目的合成(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯系列化合物并评价其吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制活性。方法化学合成(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚和一元羧酸,通过两者的酯化反应获得一系列(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯新型化合物;运用基因工程方法表达、纯化重组人IDO(rhIDO),建立酶活性检测体系;同时检测(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯化合物的IDO抑制活性。结果化学合成6个(E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯新型化合物,检测出其中3个具有高效的IDO抑制活性。结论 (E)-4-(β-溴乙烯基)苯酚酯类化合物是一类新型的具有发展潜能的IDO抑制剂。

微杆菌Microbacterium sp.FY1538降解赤霉烯酮的活性研究

赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)主要是由镰刀菌属(Fusarium sp.)的某些种,如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等通过聚酮类合成代谢途径生成并分泌的一种真菌毒素,具有类雌激素的性质.ZEN能引起家禽家畜和人的雌激素过多症,造成生殖紊乱、肝肾损伤,严重时可以致癌.本研究用环戊酮作为唯一碳源,从土壤中筛选获得一株可以有效降解ZEN的微杆菌(命名为Microbacterium sp.FY1538).该微杆菌在添加甲醇的LB培养基中发酵所得的上清液具有降解ZEN的活性.进一步的分析证明了FY1538培养液上清中含有能够降解ZEN的酶.经高效液相色谱分析,发现了ZEN生物降解的初步产物.

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.

CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫

猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已经逐渐成为我国的主要流行毒株.本研究利用马克斯克鲁维酵母研究了2.1b型CSFV E2蛋白及其截短体mE2(690-916aa)在马克斯克鲁维酵母中的重组表达,发现去除E2蛋白跨膜区域可以显著提高E2蛋白表达水平,mE2的表达量在5L发酵罐中达1.25～2.5g/L.经分子筛纯化,mE2蛋白纯度达90%.纯化的mE2作为抗原蛋白,注射免疫小鼠28d后,可诱导小鼠产生抗CSFV的IgG特异性抗体,表明马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2蛋白具有较好的免疫原性.

马克斯克鲁维酵母发酵苹果酒的化学成分与抗氧化活性

近年来,由于非酿酒酵母属酵母发酵能够产生更多的风味物质,备受酿酒师的青睐。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种食品安全级的非常规酵母,可用于生产生物酶、木糖醇和芳香化合物等。该研究以Saccharomyces bayanus SAF作为对照,通过发酵苹果酒的化学成分和抗氧化活性对比分析,研究了K.marxianus酿造苹果酒的特征。在25~35℃条件下,K.marxianus能够在96 h内完成乙醇发酵,产量约56.8 g/L。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(head space-solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析结果表明,K.marxianus发酵产生的乙酸-3-甲基-1-丁酯、辛酸乙酯、己酸乙酯等酯类物质的均高于S.bayanus。2种苹果酒液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)分析鉴定出41种抗氧化成分,其中K.marxianus苹果酒的总多酚含量比SAF苹果酒高出约17.5%。

IDO抑制剂黄连碱对Aβ与IFN-γ联用诱导的PC12细胞凋亡的影响

阿尔兹海默症（Alzheimer′s disease,AD）,又称原发性老年痴呆症,是一种致死性慢性中枢神经系统退行性疾病,发病机制复杂,主要特征包括细胞外β淀粉样斑块（amyloidβ-protein,Aβ）、细胞内神经元纤维缠结以及神经元功能紊乱或丢失。

保留型与反转型β-木糖苷酶活性位点的分子动力学模拟

木聚糖是潜在的重要可再生能源,如何提高其降解效率已成为近年来的研究热点.β-木糖苷酶是木聚糖降解过程中的关键酶之一,按其水解机制可分为保留型与反转型酶.目前虽然对于这两种催化机制的研究不断深入,但很少有工作从溶液环境的角度出发探究它们的差异.本文采用分子动力学模拟方法,对4个典型的β-木糖苷酶进行了显式溶剂模拟研究,详细分析了酶的催化氨基酸间的距离和质子供体氨基酸p Ka值的动态变化.结果显示,反转型酶催化氨基酸间的距离约为0.8-1.0 nm,大于保留型的0.5-0.6 nm,与先前对糖苷酶晶体结构的统计分析结果一致.令人意外的是,保留型酶的质子供体通过与其附近组氨酸的相互作用,其p Ka在两个不同的高、低值之间交替变换,使保留型酶的双取代反应得以发生;而反转型酶的质子供体则由附近的天冬氨酸调节,其p Ka稳定在某个较高值,这可能有利于其在反应p H值下获得水溶液中的氢离子,进行反转型酶特有的单取代反应.因此,本工作加深了人们对β-木糖苷酶保留型与反转型水解机制的认识,并为后续酶的理性改造与高效利用提供具有指导价值的结构与机理信息.

酵母重组表达PCV2病毒样颗粒的纯化工艺

猪圆环病毒(PCV)是一种引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道综合征及繁殖障碍的病毒,已经成为危害养猪业最主要的病原之一,而接种猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗是控制猪圆环病毒相关疾病最有效的措施.利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus,KM)表达猪圆环病毒PCV2 Cap的产量可达2g/L,高于其他表达系统的产量,并且重组表达的Cap蛋白在胞内能高效自组装成病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs).酵母细胞破碎之后样品中含有大量的微小的细胞碎片,高速离心澄清难以分离,影响了VLPs的得率、纯度以及澄清度.本研究考察了超声波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高压均质破碎等不同破碎方法,发现1300bar高压均质法对重组表达PCV Cap蛋白的马克斯克鲁维酵母破碎效果最佳.在此基础上,检测添加有机溶剂、表面活性剂和化学絮凝剂的处理效果,发现添加1%(质量分数)Triton X-100对酵母破碎菌液具有65%以上的浊度降低率,处理后样品可直接用于离子交换层析,得率大于92%,HPLC纯度大于85%.

深海耐盐杆菌来源酯酶PE8的表达纯化、结晶和晶体X-ray衍射研究（英文）

从深海耐盐杆菌Pelagibacterium halotolerans B2T中分离鉴定的酯酶PE8隶属于酯酶第六家族.因具有耐盐、较高的热稳定性、高手性选择性,PE8是工业上高效生产手性药物前体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯((R)-3-MFG)很有开发潜力的催化剂,但其分子催化机理并不清楚.PE8在大肠杆菌中体外表达,并通过镍柱亲和层析,以及凝胶过滤层析纯化,最终通过悬滴结晶方法获得了PE8蛋白晶体.晶体经过X-ray衍射分析获得1.66的分辨率,属于空间群P21,晶胞参数为a=41.772,b=73.398,c=66.403,β=102.37°.一个异构单元包含2个蛋白分子,溶剂(水)含量为35%.

基因组整合与游离质粒联合应用介导阿魏酸酯酶A在马克斯克鲁维酵母中高效分泌表达

阿魏酸是植物中广泛存在的酚类化学物质,具有抗氧化活性.阿魏酸酯酶能够水解植物细胞壁半纤维素和阿魏酸之间的酯键,释放阿魏酸,在食品、医药、饲料加工等领域具有广泛的应用价值.马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种生长迅速、蛋白分泌能力强的新型食品安全级酵母,具有高效分泌表达菊粉酶的能力,本研究利用基因组菊粉酶位点INU1整合与游离质粒联合应用的方式,在马克斯克鲁维酵母中实现了黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶AnFaeA的高效表达,发酵液上清中的酶活达到164.4U/mL.利用马克斯克鲁维酵母重组表达的阿魏酸酯酶能够高效降解玉米芯释放阿魏酸,释放量可达1.81mg/g,并且在β-木聚糖酶的协助下可进一步提高阿魏酸的释放量,达到2.8mg/g.

GH43家族β-D-木糖苷酶RuXyn1在马克斯克鲁维酵母中的表达及其应用

木聚糖的降解需要内切β-木聚糖酶和β-D-木糖苷酶的协同作用,β-D-木糖苷酶能将β-木聚糖酶的水解产物木寡糖降解为木糖,因此在半纤维素的利用中具有重要的意义.本研究将中国牦牛瘤胃微生物来源的糖基水解酶GH43家族β-D-木糖苷酶基因RuXyn1克隆到含两种不同分泌信号肽(菊粉酶信号肽和α-factor信号肽)的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)分泌表达载体(pUKDN132和pUKDN129)中,转化K.marxianus Fim-1 ura3Δ,通过筛选获得两株分泌表达β-D-木糖苷酶基因RuXyn1的重组菌株Fim-1/pUKDN132-RuXyn1和Fim-1/pUKDN129-RuXyn1.重组菌株摇瓶培养72h后,上清液中β-D-木糖苷酶酶活分别为0.304U/mL和0.045U/mL.在5L发酵罐高密度发酵中,Fim-1/pUKDN132-RuXyn1分泌表达的β-D-木糖苷酶酶活为1.75U/mL,而Fim-1/pUKDN129-RuXyn1的酶活为1.6U/mL,表明在表达β-D-木糖苷酶RuXyn1时,菊粉酶信号肽介导的分泌效率优于α-factor信号肽.以玉米芯为底物,我们测试了K.marxianus重组表达的β-D-木糖苷酶RuXyn1的降解效果,发现在商业化的β-木聚糖酶和纤维素酶CTec2中,添加β-D-木糖苷酶RuXyn1能够显著提升玉米芯的降解效率,还原糖产量提高7%,木糖和葡萄糖的产量分别提高12.4%和6.1%.

马克斯克鲁维酵母FIM1基因组分析

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种富有潜力的新型细胞工厂宿主菌。K.marxianus FIM1(CGMCC No.10621)基因组组装与注释已于2019年完成并在NCBI上公布(GCA_001854445.2),但在应用该基因组信息时发现其仍不完善。所以本研究使用重测序的DNA-seq数据校验了K.marxianus FIM1的基因组序列,随后补充了K.marxianus FIM1的注释,并使用比较基因组学的方法进一步完善了K.marxianus FIM1的基因组信息。根据重测序比对结果,删除了测序数据无法覆盖的位点61处,共4910bp。K.marxianus FIM1新序列总长为10909543bp,可覆盖酵母目保守基因库中99.5%的基因。同时对K.marxianus FIM1的非编码RNA、次级代谢产物基因簇的也进行了补充注释。进一步,我们使用基因组共线性分析的方法分析了K.marxianus FIM1在物种分化过程中基因排列顺序保守的区域,并将K.marxianus FIM1与NCBI公布的11株K.marxianus进行了种内基因组比较。发现12株K.marxianus早在约180万年前分化为两个亚型,它们共有的同源基因家族有4009个,基因组中核心基因平均占比为79.88%,预测K.marxianus为闭合型泛基因组,核心基因数为3760个,为K.marxianus FIM1遗传学的研究与遗传工程的改造提供了数据支持。

组蛋白H3K4甲基转移酶复合物亚基Ash2参与裂殖酵母产孢

在氮源缺乏及信息素存在的条件下,裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)进行减数分裂并完成产孢。在此过程中,信息素介导的MAPK(Mitogen-activated protein kinases)信号通路调控减数分裂相关基因的表达。Spk1是MAPK通路的核心成员,通过蛋白磷酸化的方式激活转录因子Ste11,从而激活mei2+、mam2+和map3+等减数分裂相关基因的表达。尽管组蛋白H3K4甲基化参与基因转录激活、染色质重塑等诸多生物学过程,但其在裂殖酵母产孢过程中的作用并不清楚。文章通过序列比对,发现裂殖酵母Ash2作为H3K4甲基转移酶复合物COMPASS的亚基具有两个保守的结构域,定位于细胞核内参与H3K4的甲基化修饰。ash2+的缺失引起裂殖酵母在氮源缺乏时产孢过程的延迟及产孢率下降。ChIP、定量PCR分析结果显示,ash2+的缺失降低了spk1+编码区H3K4的二甲基化水平,造成spk1+mRNA水平的明显下调。在ash2Δ细胞中,虽然ste11+的转录水平没有变化,但Ste11的靶基因mei2+、mam2+和map3+的转录水平明显下降。在裂殖酵母中,组蛋白H3K4甲基转移酶复合物COMPASS的亚基Ash2通过调控二甲基化水平修饰从而调节MAPK信号通路,参与裂殖酵母的有性生殖,为建立表观遗传修饰与减数分裂之间的联系提供了新的线索。

添加活性马克斯克鲁维酵母对肉鸡生长性能、血清生化指标和肠道结构的影响

本试验旨在研究添加活性马克斯克鲁维酵母对肉鸡生长性能、免疫器官指数、血清生化指标和肠道结构的影响.选用525只体重接近、健康的1日龄Arbor Acre肉鸡,公、母各半,随机分成5个处理组,每组7个重复,每重复15羽,对照组饲喂玉米豆粕基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加2.5×10^(10),3.75×10^(10),1.875×10^(11)和3.75×10^(11)CFU/kg的活性马克斯克鲁维酵母.结果表明:①与对照组相比,添加1.875×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高1~21日龄、22~42日龄、1~42日龄肉鸡的平均日采食量和平均日增重(P<0.05),显著降低22~42日龄、1~42日龄肉鸡的耗料增重比(P<0.05),添加3.75×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高22~42日龄肉鸡的平均日增重(P<0.05);②与对照组相比,添加不同水平活性马克斯克鲁维酵母对肉鸡免疫器官指数无显著影响;③与对照组相比,添加1.875×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高22日龄肉鸡血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05),显著降低22日龄肉鸡血清中总胆固醇、尿酸(UA)和43日龄肉鸡血清中UA含量(P<0.05),添加3.75×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高22日龄肉鸡血清中TP、ALB含量(P<0.05);④与对照组相比,添加1.875×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母提高了22日龄肉鸡血清中SOD活性(P<0.05);⑤与对照组相比,添加不同水平活性马克斯克鲁维酵母能显著提高43日龄肉鸡十二指肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值(P<0.05),其中添加1.875×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高22日龄肉鸡十二指肠绒毛高度与隐窝深度比值、回肠绒毛高度、回肠绒毛高度与隐窝深度比值(P<0.05),显著提高43日龄肉鸡的空肠绒毛高度、空肠绒毛高度与隐窝深度比值、回肠绒毛高度与隐窝深度比值(P<0.05),添加3.75×10^(11)CFU/kg活性马克斯克鲁维酵母能显著提高22日龄肉鸡十二指肠绒毛高度与隐窝深度比值、回肠绒毛高度(P<0.05),显著提高43日龄肉鸡回肠绒毛高度与隐窝深度比值(P<0.05).综上所述,添加活性马克斯克鲁维酵母能显著改善肉鸡的生长性能、血清生化指标、抗氧化能力和肉鸡肠道结构,其中添加水平为1.875×10^(11)CFU/kg时效果最佳.