重组小鼠神经生长因子前导肽和人β-内啡肽融合基因非增殖型腺病毒的构建和鉴定

目的构建并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人β-内啡肽(β-EP)融合基因非增殖型腺病毒(Ad-NEP).方法取出生2周、雄性昆明小鼠的颌下腺组织,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到PN上游部分序列,全基因合成PN下游部分和人β-EP序列并将其与PN上游部分连接成融合基因并测序.采用AdEasyTM System细菌内重组的方法构建携带小鼠PN和人β-EP融合基因非增殖型腺病毒,PCR鉴定后扩增不含野毒的阳性克隆并纯化,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度;体外转染人皮肤癌上皮(A431)细胞,3 d后RT-PCR观察融合基因的转录,免疫组化法检测细胞内β-EP的表达,放射免疫法检测感染后1、3、7 d时培养基内β-EP的浓度.结果融合基因序列正确,PCR可检测到475 bp的融合基因条带并排除野病毒株,腺病毒Ad-NEP滴度为1.5×1010pfu/ml.A431细胞转染病毒后3 d RT-PCR可以检测到475 bp大小的融合基因片段,免疫组化染色后细胞内出现橙黄色浓染颗粒,Ad-NEP组感染后1、3、7 d时细胞培养基内人β-EP浓度高于对照组(P＜0.01),感染后3、7 d Ad-NEP组β-EP浓度比感染后1 d高(P＜0.05或0.01).结论成功构建能在体外培养的非神经内分泌细胞内外高效转基因表达人β-EP的重组腺病毒.