ID-LC-MS/MS候选参考方法测定血清载脂蛋白A-Ⅰ和B的优化

目的优化检测载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)和载脂蛋白B(apoB)的同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC-MS/MS)候选参考方法。方法选5个正常三酰甘油(TG)含量(TG≤2.3 mmol/L)的样品为校准品,2个高三酰甘油血症患者和1个正常三酰甘油患者的血清为待测样品。载脂蛋白经过变性、烷基化、胰蛋白酶酶解后,经LC-MS/MS进行分离和定量。对apoA-Ⅰ的特征肽AKPALEDLR、apoB的特征肽TGISPLALIK和TEVIPPLIENR进行母子离子对的优化。结果优化后与优化前的峰面积比范围在1.5至67.2之间。优化后,定性/定量离子对的比值的不精密度降低,最高降低3.1%(AKPALEDLR 338.2/403.2),最低降低0.6%(AKPALEDLR 338. 2/532. 4)。AKPALEDLR肽段和VQPYLDDFQK肽段定量apoA-Ⅰ结果一致;TEVIPPLIENR肽段和TGISPLALIK肽段定量apoB结果除HTG2外一致。结论选择合适的离子对可以显著提高载脂蛋白相应特征肽的峰面积,降低定性/定量离子对的比值的不精密度,使定量结果更准确。

采用葡萄糖参考方法为室间质量评价样本确定靶值的应用初探

目的探讨运用葡萄糖(Glu)参考方法为室间质量评价(EQA)样本确定靶值的可行性。方法利用上海市临床检验中心参考测量实验室已建立的国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)推荐的同位素稀释气相色谱串联质谱参考方法,测定2018年上海地区第2次EQA样本Glu的含量,并以其为靶值,对参评实验室反馈结果进行统计分析。结果2018年第2次EQA有509家参评实验室以实验室检测结果中位值为靶值、允许总误差的7%为标准评价,EQA 1~5样本的不合格率分别为2.16%、2.95%、3.34%、3.14%、1.77%;若以参考方法定值结果为靶值,则不合格率分别为2.75%、3.14%、2.75%、7.86%、2.16%。结论质量评价机构应关注EQA样本的质量,临床实验室应重视低浓度下Glu测量的可靠性。

糖化血红蛋白液相色谱-质谱参考测量程序测量结果的不确定度评定

目的探讨液相色谱-质谱(LC-MS)参考测量程序(又称:参考方法)测量人全血中糖化血红蛋白(HbA_(1c))结果的不确定度评定方法。方法建立国际检验医学溯源联合委员会(JCTLM)推荐的HbA_(1c)参考测量程序——LC-MS法,按照国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)HbA_(1c)标准化工作组实验方案对样品进行测量,分析测量不确定度分量来源,评定各分量,合成标准不确定度,计算扩展不确定度,确定校准和测量能力(CMC)。结果人全血HbA_(1c)浓度为32.8 mmol/mol、71.8 mmol/mol、52.4 mmol/mol、100.9 mmol/mol、59.6 mmol/mol时,其相对扩展不确定度分别为2.9%、1.5%、1.9%、1.3%和1.7%(95%置信区间,包含因子k=2)。参考测量能力范围为32.8 mmol/mol至100.9 mmol/mol时,其CMC为1.3%。结论该参考实验室评定了LC-MS参考测量程序HbA_(1c)检测结果的测量不确定度,满足了对HbA_(1c)参考测量能力的要求。

高效液相色谱-串联质谱法检测血清油酸及其在胰岛素抵抗中的应用

目的建立高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血清油酸(OA),初步评估OA在2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗(IR)中的作用。方法用OA-[^(13)C_5]作为同位素内标物,OA和OA-[^(13)C_5]的离子对分别为281.3/281.3和286.3/286.3。ZORBAX SB-Aq C18反相色谱柱,流动相A为超纯水,流动相B为甲醇乙腈(1∶1,v/v),梯度洗脱,流速0.3 mL/min。根据EP15-A3文件,考察精密度和正确度、线性范围、稳定性、携带污染率等性能以评价该方法的可靠性。选取临床确诊T2DM患者109例及体检健康者100例,用HPLC-MS/MS检测血清OA,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评价IR,进一步分析OA与IR的关系。结果建立的检测OA的HPLC-MS/MS特异性好,在10～1 000μmol/L范围内线性关系良好,y=0.007 55x+0.004 83,r=0.997 7,定量限(LLOQ)为10μmol/L,批内不精密度(以变异系数CV表示)≤1.62%,实验室内CV≤1.73%,方法精密度较好,适合临床血清样品的测定。与健康人对照组血清OA水平(113.20±58.00)μmol/L比较,T2DM组血清OA水平(425.58±220.17)μmol/L升高,且对照组和T2DM组OA与HOMA-IR均呈正相关。以OA诊断IR的AUC为0.689,当根据约登指数确定cut-off值为235.8μmol/L时,敏感性为70.4%,特异性为63%;当OA联合FPG诊断IR时,AUC增至0.806,且与OA诊断IR的AUC比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论建立了科学、高效定量检测血清OA浓度水平的HPLC-MS/MS,为动态监测代谢性疾病人群OA含量的变化提供了可靠的方法。

液相色谱串联质谱法检测血清载脂蛋白C的酶解效率

目的分析液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测载脂蛋白(apo) C-Ⅰ、C-Ⅱ和C-Ⅲ的酶解效率,为其准确定量检测提供依据。方法对不同apo C含量的混合人血清样品进行变性、还原、烷基化等前处理,经胰蛋白酶酶解,用LC-MS/MS定量检测目标肽段;分析多肽释放图谱和样品间多肽释放的相关性。结果肽段TP(apo C-Ⅰ)、TY(apo C-Ⅱ)和GW(apo C-Ⅲ)的响应值较高。酶解1 h时,肽段ES和DA即达释放峰值; 3 h时,TY释放最充分;而TP、GW和EF的释放速率相对较慢,在8 h达最高值。TP、TY和GW达峰值后,峰面积随酶解时间延长而逐步下降。apo C-Ⅰ释放出的2条肽段EF和TP在5份样品之间一致,相关系数(r)=0.993 9(3 h)和0.992 9(20 h); apo C-Ⅱ(ES和TY肽段)和apo C-Ⅲ(DA和GW肽段)的r值介于0.976 1～0.997 3。结论 apo C-Ⅰ、apo C-Ⅱ和apo C-Ⅲ肽段的酶解效率受肽段自身特性和酶解环境影响,合适地选择代表性肽段和酶解条件将有助于其准确定量检测。

液相色谱串联质谱技术在载脂蛋白E室间质量评价中的应用

目的探讨液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)在载脂蛋白E(apo E)室间质量评价中的应用。方法分别将5份混合人血清样品冷链运送到76家实验室,用免疫比浊法(ITA)进行单次检测。以同位素标记精氨酸的肽段为内标,对标本进行变性、烷基化和胰蛋白酶酶解处理,液相色谱部分采用SB-C18色谱柱分离,质谱部分采用正离子模式和多反应监测定量。JMP13.0软件分析不同方法分组所对应的相对偏倚。结果对于所有样品,ITA检测apo E的方法组内不精密度在1.7%至20.4%之间。总不精密度在8%左右(s B~s E样品)。5个样品相对偏倚的均值分别是(按照样品浓度由低到高排列):-34.2%、-9.4%、-9.8%、-2.7%和-2.1%。高浓度样品比低浓度样品更接近LC-MS/MS检测结果。结论 LC-MS/MS检测apo E可评价免疫法的准确性,为临床应用提供帮助。

同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清17α-羟孕酮候选参考测量程序的研究

目的研究1种基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术的血清17α-羟孕酮(17α-OHP)候选参考测量程序并对其进行评价。方法2019年12月,取上海市临床检验中心员工体检留存的血清标本,采用正己烷乙酸乙酯混合液(体积比3∶2)提取加入同位素内标的血清样本,C18反向色谱柱分离,正离子电喷雾质谱仪检测,参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)C62-A文件对建立的候选参考方法进行校准曲线、检测限与定量限、基质效应、不精密度、正确度、特异性、携带污染、线性范围等基本分析性能验证。结果17α-OHP的线性范围为0.21~119.67μg/L。检测限和定量限分别为5.218 ng/L、0.116μg/L。3种不同比例(50∶50、80∶20、20∶80)的血清与溶液混合物的相对基质效应分别为-0.02%、-0.40%、-0.90%。批内变异系数(CV)在0.164、14.81、81.63μg/L浓度处分别为1.73%~2.11%、0.98%~1.71%、0.47%~0.87%,批间CV在上述3个浓度点处分别为1.82%、1.03%、0.80%。加标样本平均回收率在0.5、20、100μg/L处分别为100.4%、101.7%、102.8%;检测中国计量科学研究院标准参考物质GBW09829,结果均在规定的不确定度范围内。无携带污染和特异性干扰。结论成功建立了基于同位素稀释LC-MS/MS技术的血清17α-OHP候选参考测量程序。该候选参考测量程序有着良好的精密度和准确度,能用于常规临床检验方法的量值溯源。

基于电感耦合等离子体质谱法血清钙离子检测候选参考方法的建立

目的基于电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS),建立一种检测血清钙离子的候选参考方法。方法方法学建立.将从医院收集到的血清标本以0.3%硝酸溶液直接稀释100倍,在血清标本基质溶液中添加不同浓度钙标准溶液,配制含血清基质的标准品溶液。以锗(Ge)为内标,采用标准加入法,计算血清钙离子浓度。对所建立的候选参考方法进行线性、精密度、正确度的性能评估和方法比对。结果血清钙离子浓度在0.000~20.400 mmol/L内(稀释后浓度为0.000~0.204 mmol/L)线性良好(R2>0.9999);批内不精密度为0.22%~0.47%,批间不精密度为0.64%~0.77%,总不精密度为0.98%~1.09%;检测3个浓度SRM 956d,结果均在证书要求的不确定度范围内,相对偏移分别为-0.16%,0.04%,0.23%;该方法参加2017年参考实验室外部质量评价计划(RELA),比对通过。与检验医学溯源联合委员会(JCTLM)所列参考方法进行比较,结果一致性良好。本研究所建立的候选参考方法与临床常规电极方法进行比较,具有良好的相关性。结论成功建立血清钙离子检测候选参考方法,线性范围宽、具有良好的精密度与准确度。

同位素稀释液相色谱串联质谱定量检测血清载脂蛋白E及其表型分型的方法学建立

目的采用同位素稀释液相色谱串联质谱技术(ID-LC-MS),建立一种对血清载脂蛋白E定量检测并分型的方法.方法方法学建立.以同位素标记精氨酸的肽段为内标,对标本进行变性、烷基化和胰蛋白酶酶解处理,液相色谱部分采用SB-C18色谱柱分离,质谱部分采用正离子模式和多反应监测定量和分型.评价该方法的精密度、准确度和线性范围等.收集上海市东方医院2018年10至12月40份血清标本对ID-LC-MS和免疫法进行方法学比较.Deming回归和Bland-Altman分析用于方法学比较.SPSS24软件用于线性评价中的多项式回归分析.结果ApoE的所选酶解肽段在4h内即达释放峰值,SE肽段3h时达到释放峰值.对ApoE分型发现E3/E3、E2/E3和E3/E4型.实验室内不精密度均值为5.2%.低浓度和高浓度准确性评价标本的测定值与靶值的相对偏差分别为7.6%和3.6%.与免疫法比对,Deming回归的截距的95%置信区间为6.44~11.44(P<0.05),斜率的95%置信区间为0.77~0.89(P<0.05),两者的相关性r=0.97.两者差值的均值是-2.95mg/L,95%置信区间为-4.26~1.65mg/L.本方法在16.9~58.5mg/L内呈线性关系.结论本研究建立的ID-LC-MS方法可用于定量血清ApoE,并对ApoE进行蛋白分型.

ID—LC-MS检测血清载脂蛋白A-Ⅰ和B载脂蛋白的多肽释放研究

目的研究质谱技术检测载脂蛋白A-Ⅰ和载脂蛋白B的多肽释放情况，为准确定量蛋白提供依据。方法方法学研究。确定载脂蛋白A-Ⅰ和B的目标肽段。以目标肽段为检测对象，用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定5份市售人血清样本中的载脂蛋白A-Ⅰ和B，浓度范围分别为0.90～2.54 g/L和0.54～1.39 g/L。计算不同时间点的多个肽段释放量和速率，并绘制散点图。计算不同样本间，肽段释放量的相关系数R2。结果多数肽段在4 h内即达释放峰值。Apo A－Ⅰ的肽段VQ、DY和VS，以及Apo B的肽段TE和FP生成速度相对较慢。达到峰值后，TEV/SIL－TEV、AK/SIL－AK和VQ/SIL－VQ的比值相对稳定。对于Apo A-Ⅰ，不同肽段之间的相关性较高，R2在0.904～0.999之间；对于Apo B，部分肽段之间的相关性较低，如TG－SV的R2＝0.543（3 h）。结论Apo A-Ⅰ和Apo B不同肽段的酶解释放情况不同，合适的选择代表性肽段和酶解条件将有助于准确定量目标蛋白。