丙酸血症发病机制及诊治研究进展

丙酸血症是一种较常见的有机酸血症,临床表现缺乏特异性。既往因为缺乏可靠的诊断方法,所以确诊困难,误诊率较高。随着串联质谱和气相色谱-质谱技术在遗传代谢疾病检测中的应用,越来越多的患儿得到确诊,并得到有效的治疗。近年来有关本病的发病机制、诊断和治疗成为国内外研究热点。现就本病的发病机制和诊治研究进展作一介绍。

用基因芯片研究高苯丙氨酸诱导神经元基因表达谱的改变

为深入了解苯丙酮尿症患者高苯丙氨酸损伤神经元的可能机制,我们将体外培养3 d的胚鼠神经元随机分为两组:高苯丙氨酸组和对照组。高苯丙氨酸组加入0.9 mmol/L苯丙氨酸诱导12 h,对照组加入等体积的培养液,抽提RNA,与大鼠神经生物学芯片U34杂交,检测胚鼠原代神经元高苯丙氨酸作用下表达谱的改变,并用实时荧光定量聚合酶链式反应方法验证基因芯片的结果。发现芯片上1323条总探针组合数中有167条基因表达增加(12.6％),表达下调的已知基因数为7条,占总探针组合数的0.5％。按基因功能,表达上升的基因可分为信号转导相关基因、神经元相关基因、细胞骨架基因、代谢相关基因、离子通道基因、转录相关基因、细胞因子基因、凋亡相关基因等。研究结果证实了以前的报道,如Na+、K+-ATP酶、凋亡、氧化应激、NMDA受体、Ca2+参与了高苯丙氨酸对神经元的损伤过程。结果还显示,在高苯丙氨酸环境下,CaMK Ⅱ、Ras、P38、钙通道基因表达上升,部分与囊泡形成、神经递质释放有关的基因表达增强,与神经递质谷氨酸有关的受体和转运体基因表达上升。我们推测高苯丙氨酸可能激活轴NMDR-Ca2+-CaMK Ⅱ-Ras.-P38,引起神经元突起异常;高苯丙氨酸环境下,神经递质释放可能异常;兴奋性神经递质谷氨酸可能参与了高苯丙氨酸引起的神经元损伤。

高苯丙氨酸血症患儿尿中代谢物水平分析

目的通过检测高苯丙氨酸血症（HPA）患儿血苯丙氨酸（Phe）及尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平，探讨其血Phe水平与尿代谢产物的关系。方法研究对象为55例HPA患儿，其中20例为轻度HPA（血Phe浓度〈360mmol／L）、35例为苯丙酮尿症（PKU，血Phe浓度360M200mmol／L）；血r,he水平检测采用串联质谱干血滤纸片法；尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平检测采用尿素酶预处理气相色谱-质谱法。结果HPA患儿血Phe水平与尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平呈正相关（r=0．61～0．84，P均〈0．01）。轻度HPA与PKL噫儿尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平差异有统计学意义（P均〈0．01）；70％轻度HPA患儿及5．71％PKU患儿的尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平正常。结论HPA患儿尿中苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸水平的变化与血Phe浓度密切相关，单纯检测尿苯丙酮酸、苯乙酸及苯乳酸可能导致假阴性。

1例软骨-毛发发育不全的临床及遗传学特征分析

患儿,女,以“显著矮身材”为首发症状。母孕期超声检查多次提示四肢偏短。患儿表现为毛发细软、稀疏、色浅,四肢偏短,影像学检查提示骨骺改变。全外显子基因测序检测阴性。进一步行Sanger测序检测到线粒体处理RNA的内切酶复合物RNA组分(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease,RMRP)基因,一个非编码RNA基因,存在g.181G→A/g.255C→T复合杂合变异,g.255C→T为新发现的突变。软骨-毛发发育不全临床表现复杂,典型症状有助于诊断该病;特别是全外显子基因测序检测阴性时,应考虑该病并进行鉴别诊断;必要时完善一代测序(Sanger法)检测,以帮助确诊、评估预后及产前诊断。新发现的变异丰富了该病的基因谱。

高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立

目的建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术测定干血滤纸片中酸性葡萄糖脑苷脂酶(ABG)和酸性鞘磷脂酶(ASM)活性的方法。方法将干血滤纸片样本提取液与酶作用底物和内标的混合溶液孵育过夜,反应液经萃取、氮气吹干及复溶后采用UPLC-MS/MS检测产物浓度及内标,计算酶活性。评价该方法的线性、精密度和准确性。结果 UPLC-MS/MS测定ABG和ASM活性的批内、批间精密度为3.6%~8.4%,批内、批间准确度为101%~115%。正常新生儿中ABG和ASM活性呈偏态分布(P<0.01),以第0.5~99.5百分位数法确定ABG及ASM活性的参考区间分别为5.52~49.50和2.02~15.44μmol·L^(-1)·h^(-1)。经临床验证,UPLC-MS/MS能有效检出戈谢病(GD)或尼曼匹克病A/B型(NPA/B)患儿,检出率为100%。结论UPLC-MS/MS能同时测定干血滤纸片中ABG、ASM活性。该法快速、特异,可用于新生儿中GD、NPA/B的高通量筛查及临床检测。

9例46,XY完全性性腺发育不全患者分子遗传学分析

目的·分析9例46,XY完全性性腺发育不全(complete gonadal dysgenesis,CGD)患者的遗传学病因。方法·应用SRY基因测序、二代测序(next generation sequencing,NGS)和染色体微阵列(chromosome microarray,CMA)等分子诊断技术综合分析9例46,XY CGD患者的基因变异情况。结果·9例46,XY CGD先证者中检出4例携带SRY基因突变,其中2例携带未见报道的SRY基因致病/疑似致病突变,分别为SRY缺失突变和c.208T>C (p.Trp70Arg)错义突变;2例携带已报道的SRY基因致病突变,即c.169C>T (p.Gln57X)和c.264dup (p.Glu89fs*15)。NGS检测出1例MAP3K1基因杂合突变c.1016G>A (p.Arg339Gln),该突变为疑似致病突变。有2例散发病例经NGS检测、CMA分析未发现致病性拷贝数变异(copy number variations,CNVs)。有2例为家族病例,通过对父母为近亲结婚的两姐妹中的妹妹进行全外显子组测序,在筛选纯合区域的纯合变异后未发现明确的致病突变或可能与性发育相关的变异;CNVs分析发现两姐妹DMRT1基因内含子2中有约14 kb纯合缺失(Chr9:866,388-880,086,hg19),扩增覆盖断点的PCR测序显示健康双亲为杂合缺失携带者;而后采用PhastCons软件对内含子的缺失序列进行保守片段分析,发现2个保守的非编码元件(conserved non-coding elements,CNEs)。结论·SRY基因突变是46,XY CGD较常见的遗传学病因;发现2个新的SRY基因致病/疑似致病突变。DMRT1内含子2中14 kb纯合缺失可能是该研究中两姐妹的候选致病突变。采用不同序贯的遗传学方法逐步分析46,XY CGD患者的遗传病因,有助于全面了解46,XY CGD患者的分子病因。

气相色谱-质谱检测的564例遗传代谢病疾病谱分析

临床遗传性代谢病疑似患者9046例，进行尿气相色谱-质谱有机酸检测，共确诊患者564例（6．2％），包含28种疾病。其中有机酸血症311例，占55．1％，含13种疾病，甲基丙二酸血症最多见；氨基酸代谢病203例，占36．0％，含10种疾病，高苯丙氨酸血症及Citrin蛋白缺乏症多见；脂肪酸氧化代谢病50例，占8．9％，含5种疾病，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症多见。

遗传代谢病检测技术的应用及其结果的临床判读

近几年随着科学技术的发展,有关遗传代谢病的检测技术越来越多,主要包括检测血液代谢物的串联质谱技术,检测尿代谢物的气相色谱-质谱技术,检测基因的基因芯片技术及新一代测序技术等。另外,有些酶活性检测技术开始应用于溶酶体疾病的酶活性检测。

儿童遗传代谢病的诊断和预防

遗传代谢病finborneiTors0fmetabolism．IEM。或inheritedmetabolicdiseases．IMDl是一类因基因突变使合成的酶、受体、载体等蛋白功能缺陷，导致体内生化物质在合成、代谢、转运和储存等方面出现异常，包括氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂肪酸、内分泌激素、核酸、金属元素等代谢紊乱，也包括有些代谢物在溶酶体、线粒体、过氧化物酶体等细胞器积聚、贮积引起的疾病。这类疾病因有可测定的生化代谢物异常．故称为IEM。

串联质谱检测干血滤纸片中氨基酸质控分析

目的通过对近3年的质控结果进行分析,探讨影响检测结果的因素及应对措施。方法美国疾病控制和预防中心(CDC)每年提供4批氨基酸质控干血滤纸片,利用串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸水平。以美国CDC检测结果为标准,分析本实验室氨基酸质控结果偏差及其他实验室质控结果(213个实验室的均值)偏差之间的差异。结果本实验室每次质控结果所有氨基酸均在美国CDC检测结果95%可信区间内,且每一批结果的临床评价与美国CDC质控临床评价完全一致。本实验室质控结果偏差与其他实验室质控结果偏差比较,苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和缬氨酸均无显著性差异,瓜氨酸有显著性差异(Z=-2.945P<0.005)。结论本实验室氨基酸质控结果,达到美国CDC的质控要求,瓜氨酸检测值偏低,其阳性判断切割值设定也相应降低。

使用染色体芯片技术检测Miller-Dicker综合征1例报告

1病例资料 患儿,男,1岁1个月,因智力、运动发育落后就诊。患儿系G1P1,足月顺产,出生时无窒息,出生体质量3.4 kg,出生身长不详。患儿出生后半个月内很少睁眼,睡觉时间多。目前抬头不稳,不能独坐,不能独走,

先天性类脂质性肾上腺增生症分子遗传学分析

目的 探讨先天性类脂质性肾上腺增生症(CLAH)患者发病的分子遗传学机制。方法对1例19岁男性女性化的CLAH患者进行相关内分泌激素水平评价,并提取来自患者及其父母外周血DNA,采用PCR、DNA序列分析、家系分析和限制性内切酶图谱分析等方法对类固醇生成急性调控蛋白(StAR)基因进行分析。结果 患者基础血促肾上腺皮质激素(ACTH)和促性腺激素显著升高,基础血17羟孕酮(17-OHP)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)及睾酮水平降低,ACTH兴奋试验后17-OHP、DHEAS水平无明显增高。患者StAR基因存在复合杂合突变:外显子3存在以往未报道过的无义突变Q77X,该突变来自父亲并经限制性内切酶图谱分析证实。外显子6存在838delA移码突变,该突变来自母亲。结论 Q77X是StAR基因的一种新突变,Q77X和838delA突变可使StAR功能丧失或减弱而引起CLAH,开展StAR基因分析有助于明确CLAH的诊断。

枫糖尿病患者临床表现及质谱检测结果分析

目的探讨枫糖尿病（MSUD）患者临床特点及早期诊断方法。方法于2003年1月至2011年12月对全国送检的1．4万临床遗传代谢病疑似患者进行检测，并对上海多家医院出生的41万名新生儿进行筛查。利用串联质谱检测血中亮氨酸和缬氨酸水平，利用气相色谱-质谱检测尿中支链α-酮酸水平，诊断MSUD依据为血亮氨酸、缬氨酸水平增高及尿支链α-酮酸水平增高。结果确诊33例MSUD患者，首诊年龄中位值为0．17岁（7d～30岁），发病高峰年龄段为2～30d，其中新生儿期发病者28例（84．8％）；首诊症状主要为喂养困难（14例）、反应差、嗜睡、抽搐等，确诊为经典型。经典型患者血亮氨酸水平及缬氨酸水平中位数（范围）分别为1901（458～5804）μmol／L及600（315～1617）μmol／L显著高于正常参考值（50～300μmol／L、60～250μmol／L，均P〈0．01）。尿2-羟基异戊酸、2．酮-异戊酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-酮-异己酸、乙酰甘氨酸水平分别为262．5（5．4～624．3）、35．8（1．9～156．0）、133．8（7．4～611．5）、518．7（17．2～2121．2）及280．5（11．0～1087．9）均显著高于正常参考值（0、〈0．1、0、0及〈0．1）（均P〈0．01）。5例间歇型患者血亮氨酸、缬氨酸水平分别为402（348～958）μmol／L及556（322～808）μmol／L显著高于正常参考值（均P〈0．01），尿2-羟基异戊酸水平显著高于正常参考值（P〈0．01），其余支链α-酮酸水平稍升高。结论MSUD发病早、病情危重、临床表现缺乏特异性，血串联质谱氨基酸检测及尿气相色谱-质谱有机酸检测有助于此病的早期诊断。

肉碱缺乏所致心肌病的临床特点及治疗随访

目的探讨肉碱缺乏所致心肌病的临床特点以及左旋肉碱对其治疗效果。方法2010年1月到2011年12月收治的75例儿童心肌病患者，采用串联质谱检测干血滤纸片中游离肉碱和酰基肉碱的水平，对于确诊为肉碱缺乏症的患儿加用左旋肉碱治疗，剂量为150～250mg／（kg·d），所有患儿在治疗前和随访过程中进行临床评估，包括临床体检、心电图、胸x线片、心脏超声和外周血串联质谱检查。结果75例心肌病患儿中6例诊断为肉碱缺乏症，包括男性1例，女性5例，年龄为0．75～6岁，入院时外周血游离肉碱水平为（1．55±0．61）μmol／L（参考值10～60μmol／L），左室舒张末期直径（LVDd）为（5．04±0．66）cm，左室射血分数（LVEF）为（38．5±10．5）％。采用左旋肉碱治疗后早期复查（10～30d），游离肉碱升高至（30．59±15．02）μmol／L（t=4．79，P〈0．01），LVDd缩小至（4．42±0．67）cm（t=4．28，P〈0．01）；LVEF提高至（49．1±7．6）％（t=6．59，P〈0．01）。6例患儿都进行了6个月以上的随访，LVEF均恢复至正常水平；LVDd也进一步回缩，其中3例完全恢复至正常水平；所有患儿临床症状消失。治疗过程中仅1例出现间歇性腹泻，无其他并发症发生。结论在儿童心肌病患者中常规进行串联质谱检查有助于肉碱缺乏症的诊断；对于肉碱缺乏所致心肌病患儿采用左旋肉碱治疗可获得良好的效果。

婴儿型糖原贮积病Ⅱ型的临床特点及其转归

目的分析婴儿型糖原贮积病Ⅱ型（GSDⅡ）的临床特点及其转归，探讨其诊断策略。方法回顾性分析2005年1月至2012年12月上海儿童医学中心确诊的16例婴儿型GSDⅡ患儿的病史、首发症状、体征、生化检查结果及X线胸片、心电图、心脏超声等辅助检查结果，并对患儿的运动发育情况、生存情况等随访资料进行分析。结果16例婴儿型GSDⅡ患儿外周血酸性a-葡萄糖苷酶（GAA）活性明显低下或完全缺失，心脏超声检查发现患儿均合并有不同程度的心肌肥厚，左心室质量指数为161～616g／m2；患儿随访时均存在严重的肌力减退和肌张力低下，运动发育明显落后。15例患儿进行了肌酸磷酸激酶的检测，其中14例明显升高；15例患儿进行了丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶的检测，均明显升高；16例患儿首发症状年龄的中位数为3．6（2．0～6．8）个月，确诊时年龄6．5（3．8～9．3）个月。14例患儿已经死亡，死亡年龄9．0（4．7～18．7）个月。结论婴儿型GSDⅡ是一种致命性的疾病，进行性心肌肥厚以及肌力或肌张力减退是婴儿型GSDⅡ突出的表现，外周血GAA活性的检测是筛查婴儿型GSDⅡ的有效方法。

串联质谱分析干血滤纸片酰基肉碱方法的建立

目的 建立串联质谱方法进行干血滤纸片酰基肉碱 (acylcarnitine)分析 ,以便应用于临床相关疾病诊治和新生儿遗传代谢病筛查。方法 取含不同浓度的 8种酰基肉碱的干血滤纸片 (直径 3mm) ,包括乙酰肉碱 (C2 )、丙酰肉碱 (C3)、丁酰肉碱 (C4 )、异戊酰肉碱 (C5 )、己酰肉碱 (C6 )、辛酰肉碱 (C8)、肉豆蔻酰肉碱 (C14 )和棕榈酰肉碱 (C16 )。用含已知量相应酰基肉碱内标的甲醇萃取、盐酸正丁醇衍生后 ,用串联质谱仪检测酰基肉碱及其浓度。分析该方法的精确性、样品回收率及实测值与加入浓度之间的相关性。结果 酰基肉碱批内变异系数为 6 3%～ 9 9% ,批间变异为 10 3%～13 3%。低浓度酰基肉碱回收率为 98%～ 10 6 % ,中等浓度酰基肉碱回收率为 97%～ 10 9% ,高浓度酰基肉碱回收率为 94 %～ 10 8%。实测浓度与加入浓度之间的相关系数为 0 9986～ 0 9999。结论 串联质谱技术进行血滤纸片酰基肉碱分析 ,有较高的回收率 ,能够达到较高的精确性和准确性 ,为临床进行酰基肉碱分析提供了一项新技术。

单纯型甲基丙二酸血症患者诊治分析

目的探讨单纯型甲基丙二酸血症患者临床和遗传特点及治疗效果。方法对40例单纯型甲基丙二酸血症患者临床和遗传学特点、诊治及转归进行分析。治疗方法包括限制天然蛋白质摄人量，补充特殊奶粉、左旋肉碱及维生素B。随访内容包括发育情况、血丙酰肉碱及尿甲基丙二酸水平。结果40例确诊患者中，33例患者接受MUT基因分析，30例检出突变，占90．9％；随访30例，随访时间1个月至8年，死亡8例，存活22例中8例智力正常（其中4例来自新生儿筛查者治疗前后均无临床症状），14例遗留不同程度运动、语言发育迟缓及智力低下。治疗后患者血丙酰肉碱、丙酰肉碱：乙酰肉碱比值、尿甲基丙二酸及甲基枸橼酸水平中位数分别由24．15μmol／L 1．08、705．34和7．71降至10．50μmol／L、0.63、166．23及3．96，差异有统计学意义（均P〈0．05）。结论单纯型甲基丙二酸血症患者预后与患病类型、发病年龄及对维生素B12治疗的反应性等因素有关，新生儿期发病、维生素B12治疗无效者预后差。

甲基丙二酸血症患者143例资料分析

目的 分析甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia,MMA）患者的临床及生化特点,有助于提高临床医生对该病的认识.方法 分析143例MMA患者的临床资料及辅助检测结果,并探讨不同类型患者的表现差异.结果 143例患者中单纯型MMA 53例,MMA合并同型半胱氨酸血症90例.单纯型MMA患者多于出生后1d～1个月发病,主要表现为反复呕吐、代谢性酸中毒、高血氨等;MMA合并同型半胱氨酸血症患者多于1个月～1岁发病,主要表现为运动障碍、贫血等.单纯型MMA和MMA合并同型半胱氨酸血症患者血丙酰肉碱、丙酰肉碱/乙酰肉碱比值及尿甲基丙二酸水平中位数分别为13.54 μmol/L、0.85、632.08和7.97 μmol/L、0.67、161.04,均显著高于对照组（P＜0.01）,2组间各参数均差异有显著性（P＜0.01）.结论 单纯型MMA患者发病较早、病情较重;MMA合并同型半胱氨酸血症较常见,患者临床表现复杂多样.临床医生对于疑似患者需重视血串联质谱和尿气相色谱质谱检测,以便早诊断、早治疗.

鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症患者临床资料及质谱检测结果分析

目的 分析鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症（OTCD）患者临床表现及生化特点,以便提高临床医师对此病的认识.方法 分析2005至2013年上海交通大学医学院附属新华医院确诊的40例OTCD患者的临床表现、血氨水平、串联质谱检测的血瓜氨酸水平及气相色谱质谱检测的尿乳清酸、尿嘧啶水平,并与25名健康儿童进行比较分析.结果 OTCD患者40例,发病年龄中位数为1.4岁（3 d～29岁）,临床表现主要为喂养困难、持续性呕吐、抽搐、意识障碍、高氨血症等.患者血瓜氨酸水平显著低于对照组[6.35 （1.84 ～21.11）比13.65（10.23 ～ 24.52） μmol/L,P＜0.05].尿乳清酸及尿嘧啶水平显著高于对照组[167.77 （1.21 ～1 650.45）比0.25（0～2.32） mmol/molCr、52.67（3.50 ～338.64）比0.69（0～2.87） mmol/molCr,均P＜0.05].结论 对于血氨增高的患者,串联质谱检测血瓜氨酸降低,尿气相色谱质谱检测乳清酸及尿嘧啶升高有助于OTCD诊断.