上海地区1株SARS-Cov N基因序列分析及表达

目的通过基因克隆、序列分析以及在大肠埃希菌中的表达和分离纯化,研究上海地区1株SARS-CovN蛋白编码基因变异情况,为SARS-Cov N蛋白应用于检测SARS感染作基础.方法用RT-PCR法从患者血清样品中扩增获取SARS-Cov N蛋白编码基因,并重组于质粒pGEX-2T.双脱氧法双向测定N基因序列,与GenBank公布的89株SARS-Cov N基因序列比对分析;重组N蛋白编码基因在E.coli中表达,亲和层析法分离纯化表达产物.结果RT-PCR扩增获取SARS-Coy N基因1 269 bp,测定的核酸序列与GenBank中公布SARS-Coy N基因序列比对,变异位点数1～4 bp,其中导致1～3个编码氨基酸突变.重组N基因的表达质粒pGEX-2T/SARS-Cov N转化大肠埃希菌JM109,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,N基因在大肠埃希菌中高效表达,经亲和层析,得纯度＞90%的表达产物,表达的融合蛋白分子量为74000 Da.结论上海地区1株SARS-Coy N蛋白编码基因与已公布的89株毒株核酸同源性为99.92%～99.68%,编码氨基酸同源性为99.8%～99.3%;该基因在E.coli中表达,经分离纯化得到高纯度表达产物,为进一步应用于SARS-Cov感染检测打下基础.

重组幽门螺杆菌ureA,ureB低温表达、纯化及抗原鉴定

目的 :建立经济有效的方法 ,从大肠杆菌表达、纯化重组幽门螺杆菌尿素酶A、B亚单位。方法 :含重组表达质粒pGEX- 2T ureA ,pGEX - 2T ureB大肠杆菌分别在不同浓度IPTG、不同温度条件下作诱导培养 ,以SDS -PAGE分析表达产物 ,采用谷胱甘肽 -Sepharose 4B亲和层析分离纯化表达产物 ,以Western -blotting和ELISA对纯化产物作抗原性分析鉴定。结果 :IPTG诱导浓度为 0 .1mmol L ;诱导温度为 2 8℃ ,含重组质粒大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST -ureA、GST -ureB各约占总表达产物的 78%和87%。经亲和层析 ,得纯度 90 %以上的GST -ureA约为 14mg L ,GST -ureB约为 18mg L ;融合蛋白呈ureA、ureB抗原性反应。结论 :建立了低温诱导及纯化高纯度ureA、ureB基因表达产物的方法 ,所得纯化产物具有ureA、ureB抗原活性 ,为进一步的应用研究打下基础。

应用SELDI-TOF-MS技术建立小肾癌的血清蛋白质谱筛选模型

目的探讨SELDI-TOF-MS技术在小肾癌的筛查诊断中的应用。方法收集了111例血清标本,分别为小肾癌患者30例,肾脏良性肿瘤34例,健康人47例。应用SELDI-TOF-MS技术获得所有患者的IMAC-Cu2+蛋白芯片的表达图谱,随机采用19例小肾癌患者和26例健康人的血清蛋白质谱建立决策树模型,并用其余11例小肾癌患者和21例健康人进行双盲验证;再随机采用21例小肾癌患者和16例肾脏良性肿瘤患者的血清蛋白质谱建立决策树诊断模型,并用余下9例小肾癌和18例肾脏良性肿瘤患者的血清标本进行双盲验证。结果小肾癌与健康人的决策树诊断模型的敏感性和特异性均为100%,双盲验证后的敏感性和特异性分别为81.8%(9/11)和100%(21/21)。小肾癌与肾脏良性肿瘤的决策树诊断模型的敏感性为95.2%(20/21),特异性为100%(16/16),双盲法验证后的敏感性为77.8%(7/9),特异性为88.9%(16/18)。结论本次试验中建立的两个决策树有望通过进一步的验证用于肾癌的早期诊断和鉴别诊断中。在质荷比分别为15282.4、4215.96这2个蛋白峰中可能会发现肾癌的特异性肿瘤标记物。

应用SELDI—TOF—MS技术联合CT鉴别肾脏良恶性占位

目的探讨表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-Ms）技术在肾脏占位的良恶性鉴别诊断中的应用以及联合CT进行鉴别诊断的价值。方法96例血清标本取自62例肾癌和34例肾脏良性占位患者，患者术前均接受过CT检查。应用SELDI-TOF-MS技术获得所有患者的金属亲和-铜离子（IMAC-Cu^2＋）蛋白芯片的表达图谱，随机采用42例肾癌和22例肾脏良性占位患者的血清蛋白质谱建立决策树诊断模型，并用其余患者进行双盲验证。结果利用质荷比分别为4657．56、2955．95和3278．00的3个蛋白峰建立了1个决策树诊断模型，其敏感性为85．7％（36／42）．特异性为90．9％（20／22），双盲法验证后的敏感性为75．0％（15／20），特异性为83．3％（10／12）。而联合CT的诊断结果，建模组和验证组的诊断特异性和阳性预测值均可达100％。结论利用质荷比分别为4657．56、2955．95和3278．00的3个蛋白峰所建立的诊断决策模型有助于鉴别肾脏占位的良恶性，联合临床CT诊断可明显提高诊断的效率。