上海市某高级中学学生结核病疫情的分子流行病学分析

目的采用分子流行病学和传统流行病学相结合的方法分析2014年8-9月发生在上海市闵行区某高级中学的结核病聚集性疫情。方法根据首发患者线索，对该校全体师生分阶段采用肺结核症状筛查和胸部X线摄影检查，胸片有异常阴影者进一步行CT扫描检查，再经临床专家组会诊后筛查出可疑患者进行实验室检查（包括痰涂片、分离培养及GeneXpert MTB／RIF检测）。将收集到的结核分枝杆菌菌株进行“9＋3”12个位点（QUB11b、QUB18、Mtub21、Mtub21、MIRU26、QUB26、Mtub04、MIRU31、MIRU40、VNTR2372、VNTR3820、VNTR3232、VNTR4120）结核分枝杆菌可变数目串联重复序列（Mycobacterial interspersed repetitive unit-variable numbertandem repeat，MIRU-VNTR）多态性分析。结果密切接触者中筛查出该校学生中疑似肺结核患者12例，最终确诊肺结核患者11例，其中分枝杆菌培养阳性5例，一线抗结核药物药物敏感性试验（简称“药敏试验”）结果均敏感；GeneXpert MTB／RIF检测4例患者结核分枝杆菌复合群阳性，对利福平敏感。将本次结核病疫情首例患者菌株，以及密切接触者筛查分离培养得到的5株菌株和1株该校2012年11月确诊肺结核患者保存菌株（共7株菌株）进行“9＋3”的12个位点MIRU-VNTR基因型分型。结果显示，7例患者9个位点拷贝数均相同；3个高变位点中除1例患者在VNTR3820位点相差1个拷贝数外，其他位点拷贝数均相同。结论此次学校结核病聚集性疫情中有12例患者确诊为肺结核，其中6例患者的菌株与2012年发病患者的菌株具有同源性。因此，发现学校结核病患者应及时诊断和治疗，同时将分子诊断技术应用到结核病筛查工作中，以尽早控制疫情的发生和蔓延。

实验室检测结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药性的方法学评价

目的评估MGIT 960药物敏感性检测法、吡嗪酰胺酶(PZase)活性检测法和pncA基因序列分析法在检测结核分枝杆菌对吡嗪酰胺(PZA)耐药性中的应用价值。方法应用上述3种方法对上海市疾病预防控制中心2014年收集的207株结核分枝杆菌临床分离菌株进行PZA耐药性检测,比较3种方法的耐药性检测结果。结果在207株结核分枝杆菌对PZA的耐药性检测结果中有38株菌3种方法检测结果不一致,对其进行重复性试验,结果显示13株MGIT 960药物敏感性检测法结果为耐药的菌株重复性试验有10株转为敏感,且这10株菌株pncA基因序列分析结果均为敏感。以3种方法结果完全一致或2种方法结果一致的PZA耐药性检测结果为参考结果,MGIT 960药物敏感性检测法、PZase活性检测法和pncA基因序列分析法的敏感性分别为94.8%、100.0%和94.8%,特异性分别为93.3%、83.9%和98.0%。与参考结果的一致性Kappa值分别为0.85、0.74和0.93。结论 MGIT 960药物敏感性检测法和pncA基因序列分析法在检测结核分枝杆菌对PZA的耐药性上具有较好的一致性。MGIT960药物敏感性检测法存在假阳性,建议对MGIT 960药物敏感性检测法检测PZA耐药的样本进行pncA基因序列分析,若二者结果不符则进行MGIT 960药物敏感性重复性试验,以提高PZA耐药性检测的准确性。

GeneXpert MTB/RIF联合线性探针检测技术在耐药结核病诊断中的应用研究

选择上海市19家结核病定点医院作为研究现场,对2017年12月至2018年12月初诊为可疑肺结核患者的痰样本(3903份)同时进行痰涂片、BACTEC MGIT 960液体培养(简称"液体培养")和GeneXpert MTB/RIF(简称GeneXpert)检测,研究GeneXpert检测结核分枝杆菌的效能;对同期收集到的707例临床诊断肺结核患者的分离菌株采用线性探针检测技术(line probe assay,LPA)进行利福平耐药性检测,将检测结果与GeneXpert检测结果不一致的痰样本,用培养阳性菌株采用最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration,MIC)法和GeneXpert方法复测,比较同一例患者从痰样本中采用GeneXpert检测利福平耐药情况与其培养阳性菌株采用LPA检测利福平耐药情况的一致性。结果显示,3903例痰标本同时进行痰涂片、液体培养和GeneXpert检测,阳性检出率分别为19.63%(766/3903)、25.93%(1012/3903)、25.16%(982/3903)。GeneXpert阳性检出率高于痰涂片,差异有统计学意义(χ^(2)=34.390,P<0.001);略低于液体培养,但差异无统计学意义(χ^(2)=0.610,P=0.436)。以液体培养(培养阳性鉴定为结核分枝杆菌)为标准,GeneXpert检测的敏感度和特异度分别为81.23%(822/1012)和94.47%(2731/2891),痰涂片检测的敏感度和特异度分别为64.92%(657/1012)和96.23%(2782/2891)。对同一例患者的痰样本采用GeneXpert检测利福平耐药性,与对其培养阳性菌株采用LPA检测利福平耐药性进行比较,两种分子检测技术符合率达98.30%(695/707)。GeneXpert和LPA两种方法检测利福平耐药性符合率很高,但也可能存在漏检或过诊情况。对于检测结果不一致的情况,还需要引入其他检测方法,为精准诊断提供实验室依据。

细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌最小抑菌浓度检测中的应用

目的评估细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌(MTB)最小抑菌浓度(MIC)检测中的应用价值。方法应用分散仪法和玻璃珠振荡研磨法2种细菌分散定量方法分别制备MTB标准菌株H37Rv(ATCC 27294)和28株MTB临床分离株菌悬液,接种于TREK Sensititre MYCOTB药敏板(简称MYCOTB),进行体外药物敏感性试验。通过肉眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落形态和药物敏感性试验结果,评估细菌超声分散计数仪在MIC测定中的应用价值。结果通过肉眼观察和抗酸染色镜检,发现细菌超声分散计数仪制备的菌悬液分散效果更好。药物敏感性试验结果显示,2种方法符合率为100%。结论细菌超声分散计数仪可以提升制备MTB菌悬液的自动化程度,尤其在药物敏感性试验类定量试验中,可减少人为因素引起的定量误差,有利于检测的标准化和重现性。

上海市静安区2010-2015年肺结核传播状况及影响因素分析

目的了解上海市静安区肺结核传播状况及其影响因素。方法收集2010-2015年上海市静安区结核病定点医院诊治的肺结核患者中分离到的结核分枝杆菌进行药物敏感性试验，采用12个位点（QUB11b、QUB18、Mtub21、Miru26、QUB26、Mtub04、Miru31、Miru40、VNTR2372、VNTR3820、3232、4120）结核分枝杆菌可变数目串联重复序列（MIRU-VNTR）多态性分析，结合现场流行病学调查，分析结核分枝杆菌的成簇特征及其影响因素。结果80株结核分枝杆菌菌株总耐药率为28.75%（23/80），总耐多药率为16.25%（13/80）。MIRU-VNTR基因型分型结果显示，58例患者的分离株为单一基因型（72.50%，58/80），22例为成簇菌株，成簇比为27.50%（22/80），共分7个簇，每簇含2-10例菌株。结核分枝杆菌近期传播影响多因素分析结果显示，耐多药（OR=35.799，95%CI：4.239-302.346）和合并症（OR=7.695，95%CI：1.421-41.658）与近期传播有关。成簇病例的现场流行病学调查发现，1个簇患者含有10例耐多药结核病患者（MDR-TB），9例患者相互间认识，有确定的联系，1例患者有可能的联系。结论2010－2015年上海市静安区肺结核患者中存在一定比例的近期传播，耐多药和合并症是结核病近期传播的重要危险因素。

细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌药物敏感性试验中的应用价值

目的评价细菌超声分散计数仪在MTB药物敏感性试验（药敏试验）中的应用价值。方法采用细菌超声分散计数仪和手工法磨菌分别对MTB进行分散和比浊，将调整至1．0麦氏浊度的菌悬液分别从镜检及菌落生长计数两方面验证细菌分散效果及细菌活性。收集2015年1-6月上海市各结核病定点医院新诊断的肺结核患者痰标本中分离培养获得的MTB临床菌株726株，分别采用手工磨菌和仪器超声分散细菌2种方法制备MTB菌悬液，进行一线抗结核药物比例法药敏试验，37℃温箱中培养28d后，观察并比较2种不同方法制备的菌悬液比例法的药敏试验结果。2种磨菌方法接种的不同浓度对照培养基上菌落生长情况的比较采用配对卡方检验，P〈0．05表示差异有统计学意义。结果采用2种磨菌方法分别对726株MTB临床菌株菌悬液进行的药敏试验（比例法）结果均相同。2种磨菌方法接种的高浓度对照培养基上菌落生长情况比较差异有统计学意义（X^2=8．0，P〈0．01），细菌超声分散计数仪法在低浓度对照培养基上的菌落可数率达到97．7％，手工磨菌法可数率仅为4．3％，2种磨菌方法接种的低浓度对照培养基上菌落生长情况比较差异有统计学意义（X^2=674，P〈0．001）。结论细菌超声分散计数仪制备的菌悬液进行MTB药敏试验时，低浓度对照管菌落数量可数性好，高低浓度对照管菌落数对比明显，更利于对药敏试验结果的科学判读。用细菌超声分散计数仪进行MTB药敏试验（比例法），可增加试验操作的自动化，结果更具有客观性和可比性，可减少试验中的人为误差。与传统手工磨菌法比较，细菌超声分散计数仪不影响细菌活力，对MTB分散效果更好。

全自动显微扫描系统与人工镜检检测痰标本中抗酸杆菌的效果比较

【目的】比较全自动显微扫描系统与人工镜检检测痰标本中抗酸杆菌的效果。【方法】选择上海市5家结核病定点医院作为研究现场,连续纳入2020年1—11月肺科门诊初诊的疑似肺结核患者1519例,对收集到的每例疑似肺结核患者痰标本分别进行痰涂片和BACTEC MGIT 960液体培养(简称“液体培养”)检查。痰涂片检查采用直接涂片法制作2张痰涂片,1张采用传统萋-尼氏抗酸染色人工镜检,另1张采用自动染片机萋-尼氏抗酸染色全自动显微扫描系统进行扫描。以液体培养结果为标准,比较人工镜检和全自动显微扫描系统检测痰标本中抗酸杆菌的效能。分析全自动显微扫描系统重复性扫描结果和人工镜检复核结果。【结果】全自动显微扫描系统阳性检出率为14.4%(219/1519),人工镜检阳性检出率为16.3%(248/1519),两者差异无统计学意义(χ^(2)=2.13,P=0.145)。以液体培养结果为标准,人工镜检检测痰标本中抗酸杆菌的灵敏度60.36%(236/391)高于全自动显微扫描系统52.94%(207/391),差异有统计学意义(χ^(2)=4.38,P=0.036);2种方法检测特异度(98.94%)均较高;人工镜检和全自动显微扫描系统检查结果一致率为95.46%,Kappa值为0.826。全自动显微扫描系统重复性测试和人工镜检复核结果显示,全自动显微扫描系统重复性测试符合率为99.5%(436/438),人工镜检复检符合率为98.6%(432/438)。【结论】全自动显微扫描系统检测痰标本中抗酸杆菌特异度高,与人工镜检检测结果一致性好;相比人工镜检,全自动显微扫描系统可大大缓解人工镜检的工作强度。