组织工程骨修复颅颌面骨缺损预塑形技术的研究

目的:采用快速成型技术对组织工程支架材料进行预塑形,探讨其在治疗颅颌面骨缺损中的应用前景。方法:选择10只成年杂交犬,均拟行组织工程骨修复颅颌面骨缺损实验研究(下颌骨节段缺损,颅骨全层缺损),螺旋CT连续薄层容积扫描,数据传至工作站后行三维重建,按实验设计方案进行模拟手术,并转换成*.stl文件格式,快速成型机制造骨缺损三维实体模型,据此制作阴模,填充磷酸三钙高温烧结后制成多孔支架,复合骨髓基质细胞后回植,螺旋CT检测组织工程骨和骨缺损完全匹配情况。结果:10例均按预设计制备骨缺损三维实体模型,据此制备个性化组织工程支架材料,手术回植和骨缺损完全匹配。结论:采用快速成型技术可对组织工程骨支架材料进行预塑形,对未来组织工程技术治疗复杂性颅颌面骨缺损具有重要的临床实用价值。

应用GFP基因转染示踪BMSCs在组织工程下颌骨内的分化

目的:应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化下颌骨形成过程中种子细胞的变化与转归。方法:用GFP反转录病毒载体与疱疹性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组形成假病毒,高效转染犬骨髓间质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),将其接种于珊瑚,形成细胞、材料复合物,植入修复犬下颌骨标准缺损。术后32周取材,进行大体观察,组织学观察组织结构,免疫组化检测GFP蛋白表达情况。结果:32周后,大体可见组织工程化下颌骨形成,Van Gieson染色示新生骨大部分为成熟骨质,免疫组化显示新骨表面有GFP阳性成骨细胞,连接处无GFP阳性细胞,,珊瑚大部分降解。结论:组织工程下颌骨结构与正常皮质骨类似,新生组织表达GFP,证实组织工程下颌骨组织的形成来源于植入细胞。

犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的:犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(corallinehydroxyapatite,CHA),观察成骨情况及其转归。方法:体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs,并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上,形成细胞-材料复合物,植于9只犬右侧腹部皮下,并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材,HE染色,观察新生组织结构;通过形态计量学分析,对成骨情况量化,并行t检验。结果:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶染色阳性,免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后,无明显骨形成;12周后,实验组有较多新生骨小梁形成,苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好;26周后,实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示,实验组12周成骨量最高,差异有统计学意义。结论:犬BMSCs诱导后具有成骨活性,复合CHA后,可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下,随时间延长,局部成骨活动减弱。

组织工程舌黏膜构建的研究

目的探讨舌黏膜细胞的体外培养方法，及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物（BAMG）复合构建组织工程化黏膜的方法。方法分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养，定期观察细胞形态变化及生长增殖情况。对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体（AE1／AE3）免疫荧光染色鉴定；流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1／AE3阳性细胞百分比；细胞计数及噻唑蓝（MTT）比色法测定以判断细胞增殖能力。取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG，随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果，然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上，通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况。结果舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代，传至第4代时开始出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱。免疫荧光染色显示近100％体外培养的舌黏膜细胞AE1／AE3免疫荧光染色阳性。流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1／AE3阳性细胞百分比大于96％。舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×10^2以上。HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好。结论兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增；兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好。

CⅡTA反义基因体外转染对HLA-Ⅱ类抗原表达的抑制作用的研究

目的:针对同种异体细胞移植的免疫反应主要由HLA-Ⅱ类抗原介导,而CⅡTA基因对HLA-Ⅱ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过CⅡTA的反义cDNA抑制细胞表面HLAⅡ分子的表达。方法:以RT-PCR从HLAⅡ抗原组成型表达的Raji细胞株克隆CⅡTA反义片段(arⅡ),插入腺相关病毒载体psNAV中(pAarⅡ)。将该质粒通过脂质体稳定转染Heda细胞(pAar Ⅱ H),检测其表面HLAⅡ分子表达,并以RT-PCR检测其CⅡTA、HLA-Ⅱ(DR、DP及DQ)及Ii分子的mRNA水平。结果:pAarⅡH在重组人IFN-γ诱导下,DR、DP及DQ抗原表达分别降低了79±12%、90±15%及40±8%;同时HLA-Ⅱ及Ii分子的mRNA被明显抑制。结论:提示CⅡTA反义基因片段抑制了自身组成型及诱导型表达量,并相应阻止了CⅡTA所调控的基因(HLA-Ⅱ及Ii)的表达,从而为进一步探讨免疫耐受形成及其在组织工程中的应用奠定了基础。