软骨脱细胞基质/丝素蛋白活性支架的构建及其软骨组织工程研究

目的·利用软骨脱细胞基质(acellular cartilage matrix,ACM)与复合天然丝素蛋白(silk fibroin,SF)生物材料,构建具有双网络交联的生物活性组织工程支架,用于软骨组织再生。方法·用核酸酶消化法消化掉软骨组织中细胞相关的免疫原性成分,并将细胞外基质相关糖蛋白、胶原结构保留,用DNA、组织糖胺多糖、胶原定量试剂盒通过分光光度仪检测软骨组织脱细胞效率。将ACM和SF配置成混合溶液,通过加入乙二醇二缩水甘油醚与两者所含羟基、氨基发生亲核交联反应,冷冻干燥制成多孔仿生支架(n=5),同时以相同方法制备仅含有ACM或SF的多孔支架(n=5)。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察支架微观孔隙结构,并通过力学测试对不同组支架的力学强度、弹性模量以及回弹性进行评估,以吸水率反映支架的内外物质交换能力。分离并培养兔耳软骨细胞,接种于ACM-SF支架上,SEM观察培养1、4、7 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,活/死细胞双染色观察细胞活力状况,通过CCK-8检测支架的细胞毒性,并于裸鼠皮下植入细胞支架复合物,体内培养4周、8周后,行组织学检测。各组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果·经酶消化后的软骨脱细胞基质几乎无细胞残留,并保留了软骨细胞外基质活性成分。ACM-SF制备的复合支架具有相互连通的微孔结构和良好的弹性,湿态下多次压缩后能恢复原状,ACM-SF的吸水率达到了近20倍,为细胞黏附环境提供了有效的物质交换条件。此外,该支架无生物毒性,具有促进软骨细胞增殖的能力;组织学检测显示,ACM-SF支架可在体内再生均质、典型的软骨组织。结论·ACM-SF复合多孔支架具有良好的仿生微环境,可应用于组织工程软骨再生。

P17-BMP2多肽促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨P17-BMP2对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法体外培养Wistar大鼠BMSCs,分4组培养:对照组(A组)、成骨诱导组(B组)、成骨诱导+P17-BMP2组(C组)、单纯P17-BMP2组(D组)。A组:采用普通DMEM培养基培养;B组:含地塞米松10-7mol/L、Vit C 10 mg/L及β-甘油磷酸钠(β-sodium glycerophos-phate,β-GP)10 mmol/L的DMEM培养基培养;C组:成骨诱导液+P17-BMP2(10μg/mL)培养;D组:含P17-BMP2(10μg/mL)的DMEM培养基培养。CCK-8法检测培养第1、3、5、7天时细胞增殖情况;培养1周后,碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase,ALP),实时定量PCR检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的mRNA表达。结果与A组相比,D组对大鼠BMSCs增殖无影响,而B组对BMSCs细胞增殖具有促进作用,C组细胞增殖能力显著提高;各组碱性磷酸酶染色均为阳性,但染色强度有差异,C组>B组>D组>A组;Q-PCR检测结果显示:与A相比,B组和C组中所有检测基因的表达均显著提高。结论 P17-BMP2能协同成骨诱导剂促进BMSCs的成骨分化。

复合生物支架胶原蛋白/壳聚糖及聚乙烯醇/丝胶在大鼠膀胱扩大手术中的应用

目的评价复合生物材料胶原蛋白/壳聚糖及聚乙烯醇/丝胶在膀胱扩大手术中的效果及可行性。方法雌性大鼠21只随机分为3组,即膀胱扩大手术组(实验组:修补材料为胶原蛋白/壳聚糖+聚乙烯醇/丝胶);膀胱部分切除组(对照组)和非手术组(平行对照组)。所有3组实验动物在术后7 d、21 d、42 d进行膀胱容量测定,并取材观察其形态学及组织学改变。结果接受膀胱扩大手术的大鼠,术后各时间点的膀胱容量均明显高于其他两组。大体检查见膀胱血管纹理清晰,修补部位与正常膀胱无明显分界,结石发生率为71.4%。镜下组织学检查发现:术后7 d时,支架外层大量炎症细胞浸润,组织结构无法分清。术后42 d时,支架内层上可见泌尿上皮呈多层排列,黏膜下层增厚明显,但平滑肌层相对稀疏且排列欠规则。结论复合生物支架胶原蛋白/壳聚糖+聚乙烯醇/丝胶能成功应用于大鼠膀胱扩大手术,但存在膀胱平滑肌层再生情况不佳、成石率较高的缺点,有待进一步研究改善。