液体培养基比色法快速检测结核分枝杆菌耐药性

目的探讨液体培养基比色法在结核分枝杆菌(MTB)耐药性快速测定中的应用价值。方法将MTB分别接种于含药和不含药的液体培养基中,37℃培养6d,然后加入NaNO3试剂,37℃培养1d,进行硝酸盐还原检测试验。根据液体培养基颜色变化情况,判断药敏结果。将检测结果与Bactec-960测定结果比较,分析硝酸盐还原酶比色法检测MTB耐药性的敏感性、特异性和准确性。结果以Bactec-960检测结果为判断标准,液体培养基比色法检测链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇耐药性结果与Bactec-960的符合率分别为100.0%、96.9%、98.1%和97.5%。结论液体培养基比色法检测MTB耐药性具有很高的敏感性和特异性,且需时较短、操作简便、结果准确、不需特殊仪器设备,可作为MTB耐药性的快速筛选方法。

结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选

目的探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白10（CFP-10）／早期分泌抗原靶点6（ESAT-6）融合蛋白（CE融合蛋白）模拟抗原表位筛选中的应用。方法以抗CE融合蛋白多克隆抗体为靶分子，对随机噬菌体7肽库进行筛选，经3轮生物淘选后，随机选取18个单噬菌体进行测序分析。采用双抗体夹心和竞争ELISA方法对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定。采用间接ELISA方法，选取阳性单噬菌体与CE融合蛋白分别对20份活动性肺结核患者和10份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测。结果经过3轮生物淘选，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集。18个单噬菌体测序共获得9种序列，其中单噬菌体5、6、18的氨基酸序列均包含Trp-Asp-Ala-Thr（WDAT）保守序列，该序列与ESAT-6第58-61位氨基酸的序列一致。9种序列中各取1个单噬菌体经双抗体夹心和竞争ELISA检测，有7个单噬菌体（1、5、6、10、13、14、18，S／N值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0）确定为具有免疫活性的阳性克隆。选取含有WDAT保守序列的阳性单噬菌体5与CE融合蛋白分别对2种血清标本抗体进行间接ELISA检测结果显示，单噬菌体5对2种血清标本抗体检测的吸光度值均高于CE融合蛋白（分别为0．931±0．298 vs 0．317±0．157、0．496±0．073 vs 0．118±0．026，均P〈0．05）；单噬菌体5对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率（95％，19／20）明显高于CE融合蛋白（60％，12／20），而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率（9／10）低于CE融合蛋白（10／10）。结论利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出7个CE融合蛋白的模拟抗原表位，并获得了定位于ESAT-6第58-61位氨基酸序列的CE融合蛋白的1个线性B细胞抗原表位，提高了ELISA检测的敏感性，为进一步研究CE融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础。

结核病诊断和耐药性检测新技术

全球结核病诊断主要采用痰涂片显微镜法,但是假阴性率高达50%,且不能鉴定结核杆菌的耐药性。2008年全球结核病控制的目标是使用更加敏感、快速的检测活动性结核病和耐药结核病的新型工具。多耐药结核病和广耐药结核病的不断增多,促进了新型的商品化的和非商品化的试验方法的发展,特别是针对资源有限的、高结核负担的地区的试验方法。本综述简述当前可应用的技术,特别是最新发展的高效的结核病诊断和结核病耐药性检测技术。

噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌阿米卡星耐药性方法的建立及应用评价

目的建立结核分枝杆菌阿米卡星(Am)耐药性的噬菌体生物扩增法(PhaB)快速检测技术,并探讨其临床应用价值。方法通过不同菌量及药物浓度的筛选,建立PhaB测定结核分枝杆菌阿米卡星药敏检测方法;用该方法对108株结核分枝杆菌临床分离株进行了阿米卡星药敏检测,同步进行Bactec-MGIT 960的Am药敏检测,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果不符合的菌株测定其Am的最低抑茵浓度(MIC)。结果以细菌接种量10-3mg/ml、药物浓度2μg/ml、37℃作用48 h为药敏最佳检测条件,噬菌体检测108株结核分枝杆菌临床分离株阿米卡星敏感82株、耐药26株,Bactec MGIT 960检测敏感80株、耐药28株;2法测定均为敏感79株、均为耐药25株。以Bactec MGIT 960测定结果为判断标准,则PhaB的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值及符合率分别为89.3%、98.8%、96.2%、96.3%、96.3%。结论 PhaB检测结核分枝杆菌的Am耐药性有较高的敏感性、特异性和准确性,整个检测只需3 d,且操作简单、不需特殊仪器设备,可作为M.TB临床分离株Am药敏快速检测备选方法之一。

结核分枝杆菌Rv1385的抗原表位预测分析

结核分枝杆菌生长缓慢,难以获得足量的天然蛋白抗原。而利用基因工程技术制备重组蛋白抗原,存在着表达量低、不易纯化,以及特异性较低等不利因素。随着生物信息技术的发展,研究者可根据生物信息学软件预测,选择合成优势抗原肽段,而不需克隆整个蛋白,具有简便、经济、特异性高等特点。因此,本研究应用生物信息学方法,预测结核分枝杆菌Rv1385蛋白的抗原表位并分析其优势表位,对了解Rv1385蛋白的免疫学特性及其与结核分枝杆菌致病的关系具有重要意义。首先,从NCBI数据库下载Rv1385的氨基酸序列,然后采用生物信息学软件PSIPRED Server预测蛋白质二级结构;BepiPred 1.0 Server和ABCpred预测该蛋白的B细胞抗原表位;BIMAS、SYFPEITHI及NetCTLpan 1.1 Server预测该蛋白的CTL表位;SYFPEITHI和NetMHCIIpan 3.2 Server预测该蛋白的Th细胞表位。最后综合分析预测结核分枝杆菌Rv1385的优势候选抗原表位。结果显示,Rv1385蛋白二级结构中,α螺旋占51.8%,β折叠占41.6%,无规卷曲占6.6%;共有4个B细胞抗原位点,位于109~124、152~169、178~192、198~209氨基酸区段;3个CTL表位,位于263~271、87~95、240~248氨基酸区段;5个Th表位,位于77~91、87~101、234~247、70~84、46~60氨基酸区段。生物信息学分析显示Rv1385含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位,为该蛋白抗原表位的进一步研究及应用奠定了基础。

结核分枝杆菌CE复合物对人单核-巨噬细胞的功能表型的影响及其作用机制

目的研究结核分枝杆菌早期分泌抗原CFP-10-ES-AT-6复合物（CE复合物）对人单核-巨噬细胞功能表型的影响及其作用的细胞信号传导通路。方法分别采用ELISA法以及流式细胞仪检测大肠杆菌克隆表达纯化的CE复合物在不同时间及浓度对人单核-巨噬细胞TNF-α产生对细胞表型的影响，并且应用各种细胞信号传导通路抑制剂来探讨CE复合物作用的细胞信号传导通路。结果结核分枝杆菌CE复合物能够在早期（6～8h）诱导人单核-巨噬细胞活化，大量产生TNF-α，但在晚期（〉48h），则没有此作用；细胞信号传导通路MEK1／2和p38 MAPK的选择性抑制剂SB203580、PD98059、U0126能抑制CE的这种作用；CE复合物在早期（18h）促进单核-巨噬细胞表面抗原提呈功能分子CD80、CD40的表达。结论CE复合物在感染早期可能通过激活MEK1／2和p38MAPK刺激单核巨噬细胞活化，但在晚期则没有此作用。在感染早期可能具有重要的抗结核保护作用。

肺外结核病的实验室诊断技术应用

肺外结核病是指发生于肺部以外的全身其他脏器的结核病，由于病变部位广，临床表现复杂多样，早期诊断较为困难，误诊、漏诊率较高。鉴于实验室检查对肺外结核的诊断具有重要意义，因此快速、灵敏的实验室诊断技术研究极为重要。

加强结核病实验室诊断和耐药性检测新技术的研究和应用

结核病实验室诊断和耐药性检测技术研究一直是国内外同道关注的焦点内容。但是现行的结核病细菌学涂片检查敏感性低，常规培养需4～8周，快速仪器培养法也需2—6周，远不能满足临床快速诊断的需求。因此，快速、灵敏的结核病实验室诊断和耐药性检测新技术研究及其应用迫在眉睫。近年来，国外一些高水平杂志相继发表了一些在结核病诊断和耐药性检测中的新技术应用文章，备受国内外学者关注。

16SrDNA结合显色法芯片技术鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的建立16SrDNA结合显色法芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)鉴定分枝杆菌的方法。方法利用GenBank中细菌16SrDNA保守区序列,设计两对分枝杆菌属特异性通用引物,采用双重PCR法同时扩增16SrDNA的2个不同片段;根据已知16种分枝杆菌的16SrDNA序列,设计合成对应的特异性寡核苷酸探针。先用通用引物PCR扩增所有标准菌株DNA,PCR产物分别与16种分枝杆菌探针的玻璃芯片杂交,通过尼龙膜显色进行分析。结果应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准菌株和5种非分枝杆菌菌株,对其双重PCR、杂交、洗涤条件进行优化。确定双重PCR最佳退火温度为52℃,在该温度下除5株非分枝杆菌外均产生2条DNA片段,大小分别为272～280bp和183～192bp;杂交温度32℃、2×SSC洗涤5min、0.2×SSC洗涤1min,16种分枝杆菌的杂交效果最好,特异性达100%。结论用显色芯片法检测16SrDNA,可准确鉴别16种分枝杆菌。

显色法芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种

目的 利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法.方法 根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的分枝杆菌16S rDNA基因的保守区和突变区(第129～267位核苷酸的A突变区、第430～500位核苷酸的B突变区)分别设计引物和寡核苷酸探针,用地高辛标记引物并制备玻璃芯片.采用双重PCR技术分别对16种分枝杆菌标准株、5种非分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株(非结核分枝杆菌40株、结核分枝杆菌复合群80株)进行扩增,扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测,尼龙膜显色,以显现蓝黑色斑点作为阳性信号,并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类.根据芯片杂交结果,选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行DNA测序.结果 16种分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株经PCR扩增均各产生2条DNA片段,其中1条长度为272～280 bp,1条长度为183～192 bp.16种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交,应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准株和5种非分枝杆菌标准株的特异性为100%.120株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针a杂交,其中79株确定为结核分枝杆菌复合群,38株确定为非结核分枝杆菌(不产色分枝杆菌17株,胞内分枝杆菌8株,猿猴分支杆菌6株,瘰疬分枝杆菌5株,偶然分支杆菌2株),另3株只与分枝杆菌属探针a杂交,没有鉴定到种.选取的26株分枝杆菌临床分离株(结核分枝杆菌复合群8株,不产色分枝杆菌5株,胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各3株,瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各2株)DNA测序显示,未鉴定到种的3株分枝杆菌中,1株为结核分枝杆菌突变株,1株为 Mycobacterium lentiflavum,1株为 Mycobacterium arupense,芯片上无后2种菌株的特异性探针;其余23株菌株测序结果与芯片检测结果一致.结论 显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,具有一定的临床推广应用价值.

耐多药结核病化疗研究的新进展

耐多药结核病（multidrug—resistant tuberculosis，MDR—TB）的流行与传播给全球公共卫生所带来的影响已逐步显现，MDR—TB的防治形势也变得越来越复杂。近年来，广泛耐药结核病（extensively drug resistant tuberculosis，XDR—TB）的出现使得全球结核病控制工作雪上加霜。因此，研究优化的MDR—TB化疗方案，以提高MDR—TB的治愈率，阻断其向更为难治的XDR—TB发生与发展迫在眉睫。最近，国外有关MDR-TB治疗的研究较为深入，其中不乏值得我们借鉴的经验与精髓，仔细拜读，颇有收益，愿与广大同道分享。

吡嗪酰胺耐药性结核分枝杆菌的噬菌体检测技术研究

目的建立噬菌体生物扩增法(PhaB)快速测定吡嗪酰胺耐药性,并探讨其在结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性测定中的应用价值。方法应用建立的 PhaB 测定108株结核分枝杆菌临床分离株的吡嗪酰胺耐药性,并与绝对浓度法的药敏结果进行比较,对不符合的菌株进行最低抑菌浓度(MIC)测定和序列测定分析。结果 PhaB 检测吡嗪酰胺耐药性的最佳测定条件为 pH 值5.5、药物浓度200μg/ml、37℃作用48 h。用绝对浓度法检测108株结核分枝杆菌临床分离株,其中吡嗪酰胺敏感33株、耐药75株;用 PhaB 检测该108株结核分枝杆菌临床分离株,若以噬菌斑减少95%为判断标准,则吡嗪酰胺敏感32株,耐药76株。2种方法检测均为敏感的为28株,均为耐药的为71株,符合率为91.7%;2种方法检测结果不符的为9株,其中5株的 PhaB 结果与 MIC 结果相符,4株的结果不符,测序结果表明9株中有7株的 PhaB 结果与测序结果相符。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准,PhaB 检测吡嗪酰胺耐药性的敏感性为94.7%,特异性为84.8%,阳性预测值为93.4%,阴性预测值为87.5%,准确性为91.7%。结论 PhaB 测定吡嗪酰胺耐药性简便、快速,3 d 即可获得药敏结果,可作为吡嗪酰胺耐药性的快速筛选方法。

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的利用指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子，寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA（ssDNA）文库，以MPT64蛋白为靶物质，采取SELEX技术进行12轮筛选，将适配子库克隆、测序后，用DNAMAN软件对其结构进行分析，经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力，并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0，将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1，采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线，确定最佳阳性判定值，并构建散点图。结果经12轮筛选后，随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析，吸光度值为0．492—1．243，73．3％的适配子的吸光度值在1．0以上；二级结构分析显示，适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构，口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对；“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗（BCG）株]和阳性组（结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株）共47个菌株培养上清的检测结果显示，在临界（cut-off）值为0．61时，H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性，BCG株为阴性；阴性组标本的阴性检出率为85．7％，阳性组标本的阳性检出率为87．9％，表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测

指数级富集配体的系统进化 （ systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX） 技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点，并已用于检测多种靶物质。目前利用适体检测MTB分泌蛋白64（MPT64）及模拟胸腔积液中γ干扰素含量已有报道，由于MPT64是结核病血清学诊断的重要抗原之一，

非结核分枝杆菌肺病治疗面临的难点与困惑

非结核分枝杆菌 （ nontuberculoas mycobacteria, NTM ）肺病是最常见的NTM病。近年来，由于获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）流行及实验室检测手段提高等因素，NTM肺病的发病率呈增多趋势，在不少国家和地区已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。然而，由于大多数NTM对常用的抗分枝杆菌药物耐药，NTM肺病治疗面临诸多的难点与困惑，并引起广大临床医生的关注和重视。一、对NTM肺病治疗还是不治疗目前对NTM肺病治疗与否存在争议，其焦点主要在治疗效果多不确切、治疗费用较高及易引起不良反应，导致投入与收益不成比例。

北京基因型结核分枝杆菌感染的相关因素分析

目的研究感染北京基因型MTB菌株的危险因素及其与耐药和临床症状的相关性。方法2007年9月至2008年3月痰涂片阳性怖结核患者172例（男132例，女40例），平均年龄（56±10）岁。收集痰标本，采用罗氏培养法，培养阳性菌株行DNA提取，使用基因RD105缺失法及7个位点可变数量串联重复序列（VNTR-7）方法进行基因分型。两组间率的比较采用χ^2检验，定量资料比较采用t检验。结果172例痰标本中共得到培养阳性菌株116株，其中非MTB菌株4株，MTB菌株112株。来自上海及江浙地区的MTB菌株中北京基因型占86．6％（84／97），非北京基因型占13．4％（13／97）。女性患者的北京基因型（31／84，36．9％）明显高于非北京基因型（1／13，7．7％），初治患者中CD4／CD8〈1者北京基因型（17／41，41．5％）明显高于非北京基因型（0／7，0％），差异均有统计学意义（χ^2值分别为4．436和4．494，均P〈0．05）。采用VNTR-7分型方法，北京基因型菌株可分为31种基因型，各型之间的分布不均匀，有4种基因型集中了47．6％（40／84）的MTB菌株及43．6％（17／39）的耐药菌株。结论上海及江浙地区的MTB菌株以北京基因型为主，女性及免疫功能低下的初治肺结核患者可能是感染北京基因型菌株的危险因素。北京基因型菌株与耐药及临床症状可能无明显相关性。

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础。方法从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因，然后拼接装配成单链抗体基因，重组于噬菌粒载体pCANTAB5S，转化大肠埃希菌E．coli TG1，以辅助噬菌体拯救后，构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库。结果成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库，库容量达10^7。结论以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础，成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体。

显微镜观察药物敏感性检测技术及其在结核病诊断和耐药性检测中的应用

自20世纪80年代以来，结核发病率又呈上升趋势，据WHO估计，全球约有20亿人患有结核病，每年有880万新发病例，死亡人数约为200万。同时，耐药结核病也随之增多，使结核病的诊断及治疗变得更为困难。传统的结核病细菌学检查和耐药性测定尽管是结核病实验室诊断的金标准，但是敏感度差、且需时较久，或费用昂贵，远不能满足临床诊治的需求。因此，新的结核病诊断和耐药性检测技术一直是国内外学者探索的焦点。2000年Caviedes等建立了一种新的结核病诊断及耐药性检测技术——显微镜观察药物敏感度检测技术（microscopic observation drug susceptibility，MODS），随后该技术发展迅速，应用报道文献日益增多。现将MODS技术及其在结核病的诊断和耐药性检测进展综述如下。

结核分枝杆菌培养滤液蛋白32的克隆表达及血清学检测

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白32（culture filtrate protein32，CFP32）的重组质粒，在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白CFP32，探讨其对结核病的诊断价值。方法通过聚合酶链反应技术从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出Rv0577基因，将其克隆到pMDl8一T载体后，再亚克隆到表达载体pET21a，在大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，经纯化及复性后，通过Western blot分析，并以酶联免疫吸附试验检测160例血清抗体，其中肺结核患者97例、非结核肺部疾病患者25例，正常对照38名。结果构建了CFP32重组质粒，并在大肠杆菌中进行了高效表达，表达蛋白经SDS—PAGE分析，在约相对分子质量30000处有表达条带，镍柱纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。Western blot证实重组蛋白可以与结核患者血清特异结合。并以此蛋白进行160份血清结核抗体检测，结果敏感度为63．9％（62／97），特异度为96．8％（2／63）。结论成功构建pET21a—CFP32表达载体，并在大肠杆菌中高效表达CFP32蛋白，对其血清抗体检测证明重组的CFP32蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。