Rv0222/ESAT-6融合蛋白对结核病的诊断价值

目的:探讨Rv0222/ESAT-6融合蛋白对结核病的血清学诊断价值。方法:表达、纯化重组Rv0222/ESAT-6融合蛋白,以其为抗原包板、以酶标抗体为二抗、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结核患者、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染合并结核患者、非结核患者以及正常人血清,评价该融合蛋白对结核病的诊断价值。结果:以结核分枝杆菌感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT,简称T-SPOT)为金标准,将Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原的ELISA诊断结核病的敏感性为86%,特异性为100%;T-SPOT与ELISA对结核病的阳性检出率差异无统计学意义。结论:以Rv0222/ESAT-6融合蛋白作为抗原的ELISA对结核病(包括HIV合并结核病)的血清学诊断有一定价值。

微流芯片技术在耐药株结核杆菌检测中的应用

目的：探讨微流芯片技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的可行性。方法：根据rpoB基因最为常见的三种突变形式(531TCG→TTG，526CAC→TAC，516GAC→GTC)设计引物，用于微流芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药性，同时与常规药敏试验和DNA测序结果进行比较。结果：引物比例1：5，杂交温度52℃，杂交时间10min为最佳条件。在20株常规药敏试验为利福平敏感株中，微流芯片测出2株耐药株，并经DNA测序证实；而28株药敏试验为利福平耐药株中，1株微流芯片测定为敏感株，DNA测序证实为513位CAA→CTA突变。该法与常规药敏试验和DNA测序的总符合率分别为93.8％（45/48）和97.9％（47/48）。结论：微流芯片技术快速、灵敏、准确，可用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测。

噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌方法学研究

目的 建立噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌试验方法 ,探讨最佳检测条件。方法 应用分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌 ,比较各种检测条件对测定结果的影响 ,并将所建方法用于痰标本检测 ,结果与BIOTECLab公司产品比较。结果 1× 10 9噬菌斑形成单位 (PFU) /ml的噬菌体 ,37℃感染 6 0min可检出 2 0 0～ 5 0 0条 /ml结核分枝杆菌。杀毒剂 10 0mmol/ml,室温作用 5min可完全灭活受试噬菌体。指示细胞浓度在 1× 10 8条 /ml时 ,形成的噬菌斑清晰 ,便于计数。加热灭活的细菌和指示细胞不被噬菌体感染。H3 7Rv、H3 7Ra和牛分枝杆菌参考菌株检测结果均为阳性 ,7种非分枝杆菌和 16种常见非结核分枝杆菌检测结果为阴性 ,4种非结核分枝杆菌 (偶然、胞内、金色、草分枝杆菌 )在高浓度时 (>1× 10 5条 /ml)检测结果为阳性。重复试验结果表明 ,本法批间和批内变异系数均<15 %。痰标本氢氧化钠 半胱氨酸液化方式的阳性检出率为 94 % (49/ 5 2 ) ,显著高于氢氧化钠液化结果的 6 2 % (32 / 5 2 ,χ2 =15 0 6 ,P <0 0 1) ;预培养 1d的阳性检出率为 6 5 % (5 1/ 78) ,显著高于未预培养结果的 4 0 % (31/ 78,χ2 =18 0 5 ,P <0 0 1)。临床标本检测结果表明 ,我们的试剂与进口试剂检测结果基本相同。结论 噬菌体?

结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性四种测定方法的比较

目的探讨噬菌体生物扩增(PhaB)、Bactec960、最低抑菌浓度(MIC)和基因芯片方法在结核分枝杆菌(MTB)异烟肼(INH)耐药性测定中的应用价值。方法应用4种方法检测167株MTB临床分离株INH耐药性,并比较测定结果的敏感性、特异性和准确性。结果Bactec960检测敏感株111株,耐药株56株。若以Bactec960测定结果为判断标准,则PhaB的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为96.4%、96.4%、93.1%、98.2%和96.4%;MIC的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为92.9%、99.1%、98.1%、96.5%和97.0%;基因芯片的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83.9%、96.4%、92.2%、92.2%和92.2%。若以MIC测定耐药性结果为判断标准,则PhaB检测INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、95.6%、91.4%、100%和97.0%;Bactec960的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为98.1%、96.5%、92.9%、99.1%和97.0%;基因芯片的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为88.7%、96.5%、92.2%、94.8%和94.0%。结论PhaB检测INH耐药性具有很高的敏感性和特异性,与Bactec960及MIC的符合率很高,只需3d时间,且操作简便、不需特殊仪器设备。

基因芯片检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性研究

目的 研究基因芯片在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和异烟肼耐药相关的 4条基因上的 11个位点的 30种单核苷酸多态性设计制作芯片 ,用芯片检测结核分枝杆菌的基因突变 ,从而判断其耐药性。结果 用基因芯片在 110株异烟肼耐药株中检测出 85株 (73 3% ) ,在 30株异烟肼敏感株中检测出 2 2株 (73 3% ) ,在 94株利福平耐药株中检测出 77株 (81 9% ) ,在 4 6株利福平敏感株中检测出 4 0株 (87 0 % )。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论 用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性 ,该法快速、精确 ,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。

噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性

目的 建立快速测定结核分枝杆菌利福平耐药性的噬菌体生物扩增法 ,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法 应用噬菌体生物扩增法测定 5 2 4株结核分枝杆菌利福平耐药性 ,并与绝对浓度法结果进行比较 ,对不符合的菌株采用BactecMGIT 96 0测定其最低抑菌浓度 (MIC)。结果 噬菌体法测定 5 2 4株结核分枝杆菌临床分离株利福平敏感 30 1株、耐药 2 2 3株 ,绝对浓度法敏感 313株、耐药 2 11株 ;两法测定均为敏感 2 88株、均为耐药 198株。在 38株噬菌体法与绝对浓度法测定结果不符的菌株中 ,35株噬菌体法与MIC测定结果相符合。如以绝对浓度法药敏结果为判断标准 ,则噬菌体法测定利福平耐药性的敏感性为 93 8%、特异性为 92 0 %、阳性预测值为88 8%、阴性预测值为 95 7%、准确性为 92 7%。结论 噬菌体生物扩增法测定利福平耐药性只需 2天时间 ,操作简便 ,不需特殊仪器设备 ,可作为结核分枝杆菌利福平耐药性的快速筛选方法。

噬菌体法与BACTEC-960检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的比较研究

目的建立噬菌体生物扩增法(PhaB)快速测定乙胺丁醇(EMB)耐药性,探讨其在结核分枝杆菌(MTB)EMB耐药性测定中的应用价值。方法应用PhaB测定138株MTB临床分离株EMB耐药性,并与BACTEC960药敏试验结果比较,对耐药性测定结果不符合的菌株测定其最低抑菌浓度(MIC)。结果138株MTB临床分离株,BACTEC960测定敏感114株,耐药24株;PhaB测定敏感118株、耐药20株。两种方法测定均为敏感112株,均为耐药18株。共计130株两法测定药敏结果相符,符合率942%;结果不符8株,不符合率58%。如以BACTEC960药敏结果为判断标准,则PhaB检测EMB耐药性的敏感性为750%(18/24),特异性为982%(112/114),阳性预测值为900%(18/20),阴性预测值为949%(112/118),准确性为942%(130/138)。结论PhaB检测EMB耐药性只需3d时间,操作简便,不需特殊仪器设备,可作为MTB的EMB耐药性快速筛选方法。

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术,建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增 rpoB 基因片段,经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板,设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测 rpoB 基因耐药突变区的81 bp 序列突变情况,与 H_(37)Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌 rpoB 基因突变检测平台,32株利福平耐药株均在 rpoB 基因片段上检测到突变,22株利福平敏感株未检测到突变,检测结果与直接测序符合率达100%。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平 rpoB 基因突变。

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。

结核分枝杆菌耐异烟肼菌株与敏感菌株的比较蛋白质组学研究

目的研究结核分枝杆菌耐异烟肼菌株与敏感菌株间蛋白质表达的差异。方法应用双向电泳技术比较9株耐异烟肼菌株与7株敏感菌株的全菌蛋白表达图谱,采用基质辅助激光解吸及电离飞行时间质谱仪进行质谱分析,通过蛋白质数据库对耐药菌株和敏感菌株差异表达蛋白质相应的基因进行序列分析。结果耐异烟肼结核分枝杆菌中有20个蛋白质斑点表达量显著增加,质谱分析获得5个明确的肽质量指纹图谱,分别为 Rv1446c、Rv3028c、Rv0491、Rv2971和 Rv2145。结论差异表达蛋白的发现可能对新型抗结核药物靶点和耐异烟肼结核病诊断的分子标志物研究提供依据。

结核分枝杆菌链霉素耐药性的噬菌体检测技术研究

目的建立结核分枝杆菌(结核菌)链霉素耐药性的噬菌体快速检测技术,并探讨其临床应用价值。方法应用分枝杆菌噬菌体感染结核菌建立链霉素耐药性的噬菌体检测技术,并对最佳测定条件进行探讨;将所建立的方法用于38株世界卫生组织药敏质控株和372株临床分离株链霉素耐药性测定,并与绝对浓度法和Bactec960药敏结果比较,对不符合菌株进行最低抑菌浓度(MIC)和rpsL耐药基因检测。结果链霉素终浓度5μg/ml作用24h、噬菌体108噬菌体形成单位/ml感染60min、杀毒剂5%室温作用5min为选择的检测条件。噬菌体法检测38株药敏质控株结果完全符合。372株临床分离株链霉素耐药性检测结果表明,如以绝对浓度法药敏结果为判断标准,则本法敏感性为97.4%、特异性为91.0%、阳性预测值为81.7%、阴性预测值为98.9%、准确性为92.9%;如以Bactec960药敏结果为判断标准,则本法敏感性为97.2%、特异性为97.1%、阳性预测值为94.6%、阴性预测值为98.5%、准确性为97.1%。有22株噬菌体法药敏结果与常规药敏试验结果不符,其中的11株噬菌体法检测结果与MIC和rpsL耐药基因检测结果相同。结论噬菌体法检测链霉素耐药性快速、简便,具有很高的敏感性和特异性,可作为结核菌链霉素耐药性的快速检测方法。

细胞外组蛋白通过激活TWIK2-NLRP3通路参与脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞损伤

目的:探讨细胞外组蛋白参与脂多糖(LPS)诱导的肺泡巨噬细胞损伤的作用及机制。方法:体外培养小鼠肺泡巨噬细胞株(MH-S)并传代,取融合生长至80%时的细胞进行实验,用1 mg/L的LPS刺激细胞3 h后以50 mg/L的外源性组蛋白分别刺激细胞3、6、12、24 h(LPS+组蛋白3、6、12、24 h组),并设磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(PBS组)、LPS单独刺激组(LPS组)、外源性组蛋白单独刺激组(组蛋白组)及肝素预处理组蛋白组(肝素+LPS+组蛋白组)。各组细胞经相应处理后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)及炎性因子表达,用FluxOR TMⅡ绿色钾离子通道检测试剂盒检测细胞内K^+浓度,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)测定钾离子通道蛋白(TWIK2)、炎症小体(NLRP3)及凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达。结果:与PBS组比较,单用LPS刺激可使LDH及白细胞介素(IL-1β、IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平显著升高。与LPS组比较,加用外源性组蛋白处理后LDH及炎性因子水平显著升高,当组蛋白刺激时间为3 h时达到峰值〔LDH(U/L):123.10±1.83比85.32±1.66,IL-1β(mg/L):40.75±2.60比18.78±1.37,IL-18(mg/L):49.94±2.45比30.19±1.82,TNF-α(mg/L):36.51±1.56比20.84±1.61,均P<0.01〕。Western Blot结果显示,与LPS组比较,NLRP3、ASC及TWIK2蛋白在LPS+组蛋白组表达均明显上调(NLRP3/GAPDH:0.80±0.02比0.57±0.02,ASC/GAPDH:0.57±0.02比0.38±0.01,TWIK2/GAPDH:0.65±0.01比0.41±0.01,均P<0.01),而肝素预处理后上述蛋白表达均明显下调(NLRP3/GAPDH:0.28±0.02比0.80±0.02,ASC/GAPDH:0.25±0.02比0.57±0.02,TWIK2/GAPDH:0.35±0.01比0.65±0.01,均P<0.01),表明组蛋白可通过TWIK2活化NLRP3参与炎症反应。此外,LPS+组蛋白组细胞内K^+浓度较LPS组明显下降(荧光强度:35.48±2.53比83.92±3.11,P<0.01);与LPS+组蛋白比较,给予肝素预处理后K^+浓度明显上升(荧光强度:72.10±1.78比35.48±2.53,P<0.01),表明细胞外组蛋白可通过TWIK2致K^+大量外流从而介导NLRP3活化参与肺泡巨噬细胞炎症损伤。结论:细胞外组蛋白可致肺泡巨噬细胞炎症损伤,其作用机制可能与细胞外组蛋白激活TWIK2通道促进K^+外流从而活化NLRP3有关。