肿瘤相关新基因HC90的表达差异及初步功能研究

目的 对新基因克隆HC90进行蛋白表达、各种肿瘤组织和细胞系中表达差异检测和体内外功能研究。方法 用pET 32a融合表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)中对该基因进行表达 ,免疫小鼠制备小鼠源性多克隆抗体 ;从体外细胞集落形成试验 ,裸鼠体内成瘤实验 ,原位杂交 ,免疫细胞化学及免疫组化检测HC90基因的表达差异和对体内外细胞生长影响的生物学功能进行研究。结果 SMMC 772 1细胞系的体外集落形成试验表明 ,HC90转染组与空载体组和p5 3对照组相比集落形成数显著增加 (P <0 0 5和P <0 0 1) ;转染细胞系的裸鼠体内成瘤实验结果表明该基因对L92 9细胞系的成瘤有明显促进作用 (P <0 0 5 ) ;免疫组化结果显示HC90在人多种肿瘤组织 ,癌旁和正常组织中均有不同程度的表达 ,总体上表现为癌组织 >癌旁组织 >正常组织。结论 HC90是个新的肿瘤相关基因。

肝癌相关基因HCAP1的定位克隆和初步功能研究

目的 克隆和筛选位于染色体 17p13.3缺失区内的肝癌相关基因。方法 采用定位克隆的策略 ,通过PAC筛库和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法克隆新基因 ;通过多组织膜片Northern杂交分析其组织表达谱 ,Southern杂交分析其在肝癌组织DNA水平上的变化 ,然后通过克隆集落形成实验与MTS法测定细胞生长速度 ,初步筛选其作为肿瘤相关基因的可能性。结果 克隆到一个基因HCAP1(HCC associatedprotein 1,先前又称HC5 6 ) ,GenBank登录号为AF177341。多组织膜片杂交显示该基因在多种组织中表达 ,其中胎盘、肝脏和肌肉中表达较高。Southern杂交结果显示HCAP1基因在肝癌组织中存在缺失 ,比例为 2 5 .3% ;克隆集落形成实验与生长抑制率测定实验初步表明该基因能抑制肝癌细胞株Hep3B细胞的生长 ,抑制率为 31.8%。结论 HCAP1可能与肝癌的发生发展相关 ,是一个新的肝癌相关基因的侯选者。

微囊化肿瘤细胞生长及其基因表达的研究

目的以人乳腺癌细胞系(MCF-7)为模型,探讨肿瘤细胞在微囊化环境中的生长特性和对基因表达的影响。方法使用大功率高压脉冲微胶囊制备仪制备微囊化MCF-7细胞,观察细胞的生长和代谢特性;待微囊内的细胞体外生长成团后固定、石蜡包埋、制作连续切片,HE染色并免疫组化检测HIF-1、cyclin D1、VEGF、p53、PCNA、BrdU等相关基因的表达。以平面培养细胞做对照。结果人乳腺癌细胞微囊化后可继续生长增殖并聚集成团,同时消耗葡萄糖产生乳酸。微囊化肿瘤细胞表现出较强的增殖活性;当微囊内的细胞团增大到一定程度时中心可出现坏死区,但分布于团块外层的细胞仍具有增殖活性;HIF-1和cyclin D1主要在位于细胞团内部的细胞表达;VEGF的表达与细胞所处位置无关;未检测到p53的阳性表达。平面培养MCF-7细胞可检测到PCNA和VEGF的表达。结论微囊化肿瘤细胞呈三维立体方式生长并存在相关基因的表达,是一种介于体外单层培养和体内移植瘤试验之间的新型肿瘤细胞特性研究、抗肿瘤药物筛选的模型,具有简单、方便和经济等特点。

垂体生长激素腺瘤靶向性基因治疗系统的构建及实验研究

目的构建并评价垂体生长激素腺瘤靶向性基因治疗系统。方法构建GE7系统介导的生长激素启动子调控的基因治疗系统,通过垂体生长激素腺瘤GH3细胞及对照细胞的体外基因转染实验,观察此基因治疗系统对GH3细胞的转染能力和靶向性。结果成功构建基因治疗系统,基因转染后GH3细胞特异性表达报告基因,对照的HO8910PM和U-2OS细胞报告基因的表达不明显。结论应用GE7转染的生长激素启动子调控的基因治疗系统能靶向性地将目的基因转入垂体生长激素腺瘤细胞。

垂体生长激素腺瘤基因治疗的动物实验研究

目的利用GE7系统介导的生长激素启动子调控毒性基因治疗裸鼠垂体生长激素腺瘤,评价该系统的治疗效果。方法构建GE7系统介导的生长激素启动子调控基因治疗系统,对垂体生长激素腺瘤裸鼠模型进行治疗,并观察其治疗效果。结果治疗组裸鼠肿瘤体积缩小,而各对照组肿瘤体积均有不同程度的增加;基因治疗后荷瘤裸鼠生存期超过120d,明显超过对照组的40d左右(P<0.01)。结论GE7系统介导的生长激素启动子调控自杀基因治疗系统能有效治疗垂体腺瘤动物模型。

细胞生长相关新基因PP3105的克隆及其初步功能研究

目的 新基因PP310 5的克隆及其初步功能研究。方法 分离和克隆新基因PP310 5的全长序列 ,在生物信息学分析的基础上 ,采用克隆形成、亚细胞定位、生长曲线等实验对该基因进行初步功能研究。结果 实验表明PP310 5有两个不同的转录本 ,并表现出一定的组织特异性 ;染色体定位于 4q2 2 2 4 ;蛋白定位于细胞膜和细胞浆中 ;克隆形成实验显示有明显的体外集落抑制作用 ;生长曲线实验表明PP310 5在SMMC772 1细胞中的表达对细胞增殖有抑制作用。结论 新基因PP310 5可能是一个新的金属离子尤其是锌的转运蛋白 ,并且与肝癌细胞的生长、增殖相关。

肝癌细胞系中肝癌转移相关候选基因启动子区域CpG岛甲基化和表达水平的相关性研究(英文)

背景与目的:DNA甲基化被认为是反映细胞内DNA转录状态的重要表观遗传学标记。本研究旨在对启动子区域CpG岛的甲基化与基因转录水平的相关性进行评估。方法:采用甲基化特异性PCR的方法确定7个与肝癌转移相关的候选基因的启动子区域在6个肝细胞系(包括5个肝癌源性的)中的甲基化状态,并通过半定量PCR的方法确定6个基因稳定态的mRNA水平。结果:仅有纯合和杂合去甲基化的基因状态得到发现。RT-PCR分析表明除了OXCT基因在其处于杂合去甲基化状态的HepG2和HCCLM3细胞中不表达,在其他的情况下,7个候选基因均有表达。讨论:本研究中的7个肝癌转移相关基因的甲基化状态仅在细胞系中部分的反映了基因的转录状态,提示其它转录调控机制的存在。

丰富生存环境对肿瘤的抑制作用及其相关基因通路分析

目的探讨丰富生存环境(EE)对肿瘤抑制作用及可能机制。方法 EE饲养环境为12只以上小鼠置大空间笼饲养,笼内设有用于小鼠探索、学习和运动的玩具。小鼠置EE环境饲养3周后,皮下接种B16F10恶性黑色素瘤细胞或Panc02胰腺癌细胞,置原环境继续饲养,比较EE组和常规环境(SE)饲养组小鼠的成瘤率和瘤重。APCMin/+基因突变小鼠3周龄起分别置EE和SE环境饲养,20周龄时处死小鼠,比较两组小鼠小肠腺瘤数量。实验还采用Agilent小鼠全基因组44K表达谱芯片对Panc02胰腺癌细胞移植瘤组织进行基因表达差异分析。结果与SE饲养比较,EE饲养对B16F10恶性黑色素瘤和Panc02胰腺癌皮下瘤的生长均有显著的抑制作用,抑瘤率分别为43.0%(P<0.05)和58.2%(P<0.01);EE对APCMin/+小鼠肠道腺瘤的生成也具有明显的抑制作用(P<0.05)。Panc02胰腺癌细胞移植瘤表达谱芯片结果的KEGG分析显示,有2倍以上表达差异的基因通路富集于细胞粘附和线粒体功能,并与神经退行性疾病和心脏疾病相关基因有交集。结论 EE对肿瘤的发生发展具有广泛的抑制作用,其对肿瘤细胞内线粒体功能的影响及其生物学意义值得深入研究。

CPGL的基因结构及其与肝癌相关性的研究

目的 克隆carboxypeptidaseofglutamatelike(CPGL)全长cDNA ,初步探讨它在肝癌发生发展中的作用。 方法 通过5’ RACE方法和RT -PCR验证 ,确定 (CPGL)全长序列 ,根据其全长与人类基因组的比较进而确定基因的染色体定位和其外显子、内含子 ;应用WesternBlot方法检测CPGL在肝癌组织和癌旁组织中的表达 ;细胞克隆形成及生长曲线检测CPGL对肝癌细胞生长的影响。结果 CPGL全长 2 6 16bp ,编码 4 75个氨基酸的蛋白 ,染色体定位于 18q2 2 .3,蛋白产物定位于细胞质中 ,WesternBlot结果发现CPGL在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。将CPGL转染肝癌细胞系SMMC772 1发现其具有抑制生长的作用。同源比较发现CPGL含有M2 0蛋白酶家族的保守功能域。结论 上述发现表明CPGL是具有潜在抑癌作用的基因。

酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究

目的 分离和克隆肝癌相关基因。方法 我们用高通量功能筛选和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2 (homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)。结果 LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达 ,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1Hs- 1。放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体 1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用 ;另外 ,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用 ,提示该基因可能参与细胞的生长调控。结论 LASS2是一个新的肝癌相关基因。

人卵巢癌相关候选基因HE4(WFDC2)的转录调控主要由Sp1与位于-71和-48的Egr-1位点结合所介导

目的 阐明HE4基因转录调控机制的细节。方法 1.用半定量RT PCR的方法评估HE4基因在肿瘤细胞株中的表达情况 ;2 .以荧光素酶报告基因载体为基础 ,对HE4基因的上游顺序构建了 3′、5′缺失突变和一系列连接体扫描突变 ;3.通过瞬时转染 /体外双荧光素酶报告系统对这些重组质粒中插入片段进行启动子活性的分析 ;4 .针对蛋白和关键顺式区域的结合的特异性和能力 ,开展泳动滞后和抗体介导的超迁移分析。结果 通过对 ( 186 0 /+ 2 9)的HE4基因上游片段及其剪切体的分析 ,将HE4基因最小启动子确定为 10 7/+ 15的DNA片段。通过对连接体扫描突变体的分析 ,将关键的顺式作用元件确定在W4 5 ( 71/ 4 8)片段 ,生物信息学提示该区存在两个Egr 1位点。通过用已知的反式作用因子与报告基因质粒分别进行共转染 ,提示Sp1是最为有效的反式作用因子 ,而不是Egr 1。通过泳动滞后和抗体介导的超迁移实验 ,证实Sp1确实是参与作用的转录因子。结论 HE4基因的转录活性主要是由转录因子Sp1与位于 ( 71/ 4 8)区域的两个Egr 1位点结合所介导的。

11株肝癌细胞系染色体17p13.3和p53基因状况的研究

目的了解１１株肝癌细胞系染色体１７ｐ１３．３区基因组结构和ｐ５３基因状况，为今后更好使用这些细胞株提供信息。方法应用染色体微卫星标志ＰＣＲ扩增，同位素标记，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以及染色体可变数目重复排列序列ＶＮＴＲ标志ＹＮＺ２２的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测各细胞株染色体１７ｐ１３．３区基因组结构和ｐ５３基因状况。结果通过上述检测，获得了１１株肝癌细胞在染色体１７ｐ１３．３区８个位点的结构状况。发现来源于我国上海地区构建的６株细胞系在染色体１７ｐ１３．３区各个位点的结构状况基本一致。ＣＣＬ细胞株在该区的两个位点呈纯合子缺失。上述６株细胞系在染色体１７ｐ１３．１区的ＴＰ５３位点呈杂合子，且微卫星重复序列的大小一致，ＣＣＬ及Ｈｅｐ３Ｂ细胞系在ｐ５３基因外显子５，６，７，８基因组片段有缺失，其它细胞系在该区有正常大小的基因组片段。结论本研究提供了１１株肝癌细胞系在染色体１７ｐ１３．

新型基因转移系统介导p21基因治疗人脑胶质瘤的体外研究

目的：探索靶向性非病毒载体系统在人脑胶质瘤基因治疗中的应用。方法：组建了ＥＧＦ－Ｒ介导的ＧＥ７基因转移系统，分别与β－ｇａｌ报道基因和ｐ２１基因构成载体复合物，体外转染Ｕ２５１细胞，通过Ｘ－ｇａｌ染色、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、原位末端标记、ＤＮＡ梯带检测等，观察了外源基因的导入及对肿瘤细胞的抑制作用。结果：Ｘ－ｇａｌ染色表明，外源基因的导人率可达８０％；转染ｐ２１基因后，细胞生长受到明显抑制，第７天生长抑制率约５８％。原位末端标记及 ＤＮＡ梯带检测发现，转染细胞有明显的凋亡发生。结论：ＧＥ７载体系统能高效靶向地将外源基因导入肿瘤细胞，外源基因的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长，有效诱导其凋亡。

高血压患者及大鼠线粒体ATPase 6基因的克隆、表达与突变研究

目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法（Differentialhybridization）筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆，得到多个在自发性高血压鼠（SHR）心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒，PCR－SSCP和测序，进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase6基因构象改变,8701位碱基由G→A（G8701A），编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸；A8708G，编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase6基因8584位碱基突变（G8584A），编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸，这一变化与SHR线粒体ATPase6基因改变相一致。结论：高血压病患者外用血白细胞线粒体ATPase6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义，并可能是高血压病的特异性改变。

表皮生长因子受体介导的多肽载体系统对人喉鳞状细胞癌的基因导入研究

目的 检测一种新的以头颈肿瘤细胞表面受体为靶向的多肽基因导入系统对人喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )的基因导入效果。方法 链霉亲和素标记生物素 (labeledstreptavidinbiotin ,LSAB)法检测喉癌组织标本和培养的Hep2喉癌细胞表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的表达。建立人喉癌裸鼠移植瘤模型 ,分别构建绿色荧光蛋白标记基因和多肽载体系统、半乳糖苷酶报告基因和多肽载体系统四元复合物 ,分别进行报告基因和标记基因的体内外导入实验。结果 EGFR在 6 5 % (15 / 2 3)喉癌组织标本呈阳性表达。Hep2细胞的EGFR亦呈阳性表达。EGFR主要位于细胞膜 ,部分位于细胞质内。绿色荧光蛋白基因转染Hep2后 4 8h显微镜下可见荧光 ,72h达高峰 ,导入率大于 80 % (78/ 97)。β 半乳糖苷酶报告基因荷人喉癌裸鼠移植瘤瘤内转染 12h即表达蓝染 ,2 4h蓝染程度加深 ,72h仍有表达。 结论 EGFR广泛存在于人喉癌细胞 ,新的多肽基因导入系统借助于EGFR可靶向性将报告或标记基因导入体内外人喉癌细胞 ,并得到高效表达 ,为头颈鳞癌的基因治疗提供了一个新的靶向高效的基因导入系统。

人细胞生长相关5个新基因的染色体定位及其基因结构

基因的染色体定位对我们研究基因相互关系、基因的组织与进化及理解基因与疾病关系具有重要的意义。本文采用RH -PCR方法及生物信息学方法对PP3898、PP115 8、PP75 3、SP2 6 0、HC5 6等 5条人细胞生长相关新基因进行染色体定位 ,并分析了其基因结构。PP3898及PP115 8定位于 19p13 3,PP75 3及SP2 6 0定位于 1q2 1 1,HC5 6定位于 17p13 3。PP3898含有 19个外显子和 18个内含子 ,可读框为 2 5 6 5bp ;PP115 8含有 7个外显子和 6个内含子 ,可读框为 12 18bp ;SP2 6 0含有 10个外显子和 9个内含子 ,可读框为 6 90bp ;HC5 6为单外显子 ,可读框为3141bp。另外 。

基因功能研究中线粒体定位方法的比较

目的 比较和选择最佳细胞线粒体定位方法及其适用范围。方法 采用免疫细胞化学、免疫组织化学、荧光免疫细胞化学和活细胞培养法对不同细胞系和癌细胞的线粒体定位方法进行比较。结果 几种线粒体定位方法各有其特征和适用范围 ,但均具很高的特异性。结论 免疫组化法可用于组织中 (即体内 )细胞线粒体的显示 ;免疫细胞化学。

新基因pp3774的亚细胞定位以及在肝癌细胞系和组织中的表达谱研究

目的探讨新基因pp3774在肝癌细胞系、人肝癌及癌旁肝、肝硬化以及正常肝组织中的表达差异及其生物学功能。方法脂质体转染-荧光观察pp3774-GFP融合蛋白的亚细胞定位；合成新基因pp3774特异性多肽,制备兔源性多克隆抗体；用RT-PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学及免疫组化方法检测pp3774基因在7个肝癌细胞系及214例肝细胞癌、18例肝硬化及10例正常肝组织中的表达差异。流式细胞术检测转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡率。结果 pp3774蛋白主要定位于细胞质(内质网为主)；RT-PCR检测结果表明pp3774 mRNA在肝癌细胞系BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L,及HepG2中高表达,SMMC-7721、MHCC-LM3及人永生化肝细胞系L-02中度表达,而在Hep3B中低表达；肝癌及癌旁组织中pp3774mRNA的表达表现为癌旁高于癌(P<0．05)；免疫组化结果显示pp3774蛋白表达程度依次为正常肝≥肝硬化≥癌旁肝组织>肝癌。转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡发生率高于对照组约10％。结论 pp3774基因是一个具有抑制肝癌细胞生长功能的新基因。