小细胞肺癌2F7单抗ScFv的高效表达及复性研究

目的在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法利用:PCR方法将2F7单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一人工设计的柔性连接肽(Linker)连接,再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中,构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv。将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和稀释复性。结果 获得了2F7单链抗体的高效表达,表达蛋白大小约27.4kD,以包涵体形式存在。包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后,获得了有功能的单链抗体。结论 成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体,并对其进行了纯化和复性,将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用。

小细胞肺癌抗独特型单链抗体的表达及活性研究

目的:在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法:从SCLC抗独特型抗体3F6小鼠杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录为cDNA。利用小鼠抗体骨架区共用引物,PCR扩增单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过人工设计的柔性连接肽(Gly4Ser)3连接构建3F6ScFv。再将其重组到原核表达载体pQE31中,构建3F6ScFv表达载体。转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,用NiNTA树脂对表达产物进行变性纯化。通过凝胶(SephacrylS200)柱上在位复性后,用竞争ELISA检测复性的3F6ScFv活性。结果:获得了SCLC抗独特型抗体3F6的VH和VL基因,构建了3F6ScFv表达质粒。在大肠杆菌中高效表达3F6ScFv,表达蛋白的相对分子质量为32×103,以包涵体形式存在。纯化后获得较纯的3F6ScFv蛋白,经复性后可竞争2F7抗体与SCLCNIHH128细胞结合。结论:成功构建、表达、纯化和复性了SCLC抗独特型抗体3F6ScFv,获得有活性的3F6ScFv,为SCLC抗独特型抗体的进一步研究奠定了基础。

抗人整合素β3亚基单克隆抗体的制备及其抗肿瘤活性的研究

目的制备抗人整合素β3亚基的单克隆抗体(mAb),研究其对肿瘤治疗的作用。方法用RT-PCR方法扩增人β3胞膜外基因,将其克隆至原核表达载体pQE30中,获得含β3胞膜外基因的高效表达载体pQE30-β3,将其转化大肠杆菌M15,通过诱导表达及纯化,获得β3蛋白。将此蛋白免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗β3亚基mAb,Western blot鉴定mAb的特异性。通过小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验筛选出具有抑制肿瘤生长作用的mAb。进一步用MTT法及流式细胞术观察该mAb体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及诱导其凋亡的作用。结果扩增获得了β3胞膜外基因,构建了β3蛋白的原核表达载体,表达纯化了β3蛋白,成功制备了8株mAb,Western blot证明了其特异性。经过体内抑瘤实验筛选出一株具有显著抑制肿瘤生长的mAb4F12。该mAb可抑制HUVEC细胞增殖并诱导其凋亡。结论成功表达了β3蛋白,并制备了有活性的mAb,抗体具有抑制肿瘤生长的作用,这可能是通过抑制血管内皮细胞的增殖和诱发凋亡实现的。

抗人小细胞肺癌单抗4B3重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

目的 获得抗人小细胞肺癌单抗 4B3的重 ,轻链可变区基因。方法 根据小鼠免疫球蛋白可变区骨架区的保守序列分别设计了 4B3单抗重 ,轻链的可变区基因体外扩增的两对引物 ,从体外培养的 4B3杂交瘤细胞中提取总RNA ,反转录成cD NA ,以cDNA为模板 ,分别用设计的两对引物进行PCR扩增 ,扩增出的重 ,轻链基因片段 ,分别插入载体 pT Adv中 ,筛选出阳性克隆 ,并测序、分析。结果 重链可变区基因全长 345bp ,编码 115个氨基酸 ,轻链可变区基因全长 315bp ,编码 10 5个氨基酸。结论 上述研究为 4B3单抗的进一步改造和利用提供了实验基础。

小细胞肺癌抗独特型疫苗功能的试验研究

目的探讨小细胞肺癌(SCLC)抗独特型抗体3F6和其单链抗体(3F6ScFv)诱导体液和细胞免疫应答的能力,以证明其作为抗SCLC疫苗的可行性。方法3F6和3F6ScFv(Ab2)免疫BALB/c小鼠获得抗血清,以ELISA和Westernblot方法分别检测抗血清中Ab3结合SCLC细胞膜表面特异抗原(NCI H128抗原)的能力,用竞争Westernblot检测Ab3与2F7竞争结合NCI H128抗原的能力。以迟发型超敏反应(DTH反应)和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测3F6及3F6ScFv诱发细胞免疫应答的潜能。结果ELISA和Westernblot方法均证明,3F6和3F6ScFv免疫同系小鼠所产生的Ab3能特异的与NCI H128抗原相结合,与对照血清相比,差异有统计学意义(P<0.001),且有很强的与2F7(Ab1)竞争结合靶抗原的能力。在DTH反应中,3F6和3F6ScFv所致小鼠足垫肿胀的程度均明显高于对照组(P<0.001)。小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应试验证明,用3F6和3F6ScFv免疫的小鼠脾脏淋巴细胞对靶细胞的再次刺激有明显的增殖反应,与阴性肿瘤细胞对照组和阴性抗体对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗独特型抗体3F6和3F6ScFv均有模拟SCLC细胞膜表面特异抗原的能力,成功诱导了相应的体液和细胞免疫应答,可作为抗SCLC疫苗进行深入研究。